СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ЧАЕВ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ НА МОДИФИЦИРОВАННОМ ЭЛЕКТРОДЕ

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности разных экстрактов чаев.

Потребляемая нами пища и состояние окружающей среды оказывают существенное влияние на биологическое производство свободных радикалов.

Свободные радикалы имеют один и более одного неспаренных электрона и обладают повышенной реакционной способностью в радикально-цепных процессах в организме человека и животных. На сегодняшний день медиками и биохимиками доказано, что в избытке радикалы способны вызывать развитие патологических состояний, таких как: рак, инфаркты, сахарный диабет и др. Соединения, способные связывать содержащие неспаренные электроны частицы с образованием менее активных, являются антиоксидантами. Антиоксиданты играют важную роль в регуляции протекания свободно-радикальных превращений в организме, существенно влияя на его состояние, поэтому антиоксиданты и исследование антиокислительных свойств биологически активных соединений в последнее время получили широкое распространение. Однако для контролируемого потребления антиоксидантов необходимо знать не только их содержание в продуктах питания и напитках, а также их антиоксидантную активность. При большом содержании антиоксиданты становятся проантиоксидантами.

Среди традиционных продуктов питания, характеризующихся антиоксидантной активностью, особое место занимает чай. Этот популярный напиток давно зарекомендовал себя как продукт, содержащий антиоксиданты, что привело к появлению широкого спектра фармакологических, косметических препаратов и разнообразных биологических добавок на основе экстрактов чая (чаще всего зеленого). Предполагается, что такие препараты препятствуют оксидативному стрессу благодаря фенольным соединениям, входящим в состав таннино-катехиновой смеси чая (фенолкарбоновым кислотам, низкомолекулярным катехинам, таннинам и т.д.).

Поэтому первоочередной задачей становится проведение достоверных измерений антиоксидантной активности экстрактов чая.

Среди электрохимических способов определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ известен способ с использованием амперометрического метода (RU 2238554 С1, опубл. 20.10.04).

Изобретение относится к области фармакологии, фармации и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности различных многокомпонентных смесей без их предварительного разделения. Способ включает подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов, их регистрацию и расчет антиоксидантной активности по предложенной математической зависимости. Подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью.

Недостатком этого способа является использование дорогостоящих стандартных веществ, обладающих высоким редокс-потенциалом.

Известен способ вольтамперометрического определения суммарной антиоксидной активности биологически активных веществ на стационарном стеклоуглеродном электроде в аммиачных буферных растворах методом вольтамперометрии (RU 2356050 С1, опубл. 20.05.09), который включает подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление на стеклоуглеродном электроде в трехэлектродной электрохимической ячейке в аммиачных буферных растворах. Регистрацию вольтамперограмм осуществляют в классическом или дифференциальном режиме с последующим использованием значений высоты регистрируемых волн (пиков) для расчета антиоксидантной активности по формуле. Этот способ осуществляют в обычной стеклянной термостатируемой трехэлектродной электрохимической ячейке с использованием электронного полярографа и двухкоординатного самописца.

Недостатком известного способа является громоздкая установка и использование дорогостоящих стандартных веществ.

Известен способ, позволяющий определить суммарную антиоксидантную активность биологически активных веществ методом катодной вольтамперометрии на ртутно-пленочном электроде в различных фоновых электролитах в области потенциалов от 0,0 до -0,6 В (Короткова А.Н., Лукина А.Н., Гончаров Л.А. и др. Сборник докладов научно-практического семинара «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения». М., 2004. - С. 182-192). Суть этого способа заключается в том, что в качестве модельной реакции, лежащей в основе методики, используется процесс электровосстановления кислорода, идущий по механизму, подобному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животных, а также в тканях растений.

Измеряется первая катодная волна восстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде в различных фоновых электролитах (фосфатный буфер, для апротонных сред 0.1 M NaClO₄ и для биологических объектов - 0,9% NaCl) в области потенциалов от 0,0 до -0,6 В. В качестве критерия антиоксидантной активности биологически активных веществ предлагается использовать параметр, отражающий количество «обезвреженных» активных кислородных радикалов за минуту времени, мг/л·мин.

Несмотря на хорошую воспроизводимость метода к недостатку способа определения антиоксидантной активности следует отнести использование ртутно-пленочного электрода, для получения которого применяют токсичные соли ртути или металлическую ртуть.

Наиболее близким по назначению и совокупности существенных признаков является способ определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов смесей чая вольтамперометрическим методом на ртутно-пленочном электроде (В.М. Мисин, Н.Н. Сажина, Е.И. Короткова. Измерение антиоксидантной активности экстрактов смесей чая электрохимическими методами // Химия растительного сырья. 2011. №2. - С. 137-143).

Недостатком этого способа является использование ртутно-пленочного электрода, для получения которого применяют токсичные соли ртути или металлическую ртуть.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой точностью и воспроизводимостью оценивать суммарную антиоксидантную активность экстрактов чаев методом вольтамперометрии на модифицированном электроде.

Согласно изобретению способ определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов чаев методом вольтамперометрии на модифицированном фталоцианином кобальта Со(II) платиновом электроде включает подготовку модифицированного электрода и определение антиоксидантной активности экстрактов чаев, которое проводят при скорости развертки потенциала 40 мВ/с и рабочем диапазоне потенциалов от 0 до -1,2 В, используя для расчета кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных форм, прореагировавших с антиоксидантами за минуту времени. В качестве фонового электролита для водно-спиртовых сред используют 0,1 моль/дм³ NaClO₄, растворенный в диметилформамиде.

Модифицированный электрод представляет собой платиновый электрод (PtЭ), на поверхности которого закреплен модификатор - фталоцианин из насыщенного раствора серной кислоты посредством сил адсорбции.

Методика модификации платинового электрода

Методика включает следующие стадии:

1. Обработка поверхности платинового электрода азотной кислотой для удаления всевозможных органических и неорганических загрязнителей.

2. Удаление азотной кислоты, промывание электрода дистиллированной водой, сушка поверхности.

3. Нанесение фталоцианин Со (PtCo(II)) на платиновый электрод посредством сил адсорбции из насыщенного раствора данного металлокомплекса, растворенного в серной кислоте (0,1 М).

4. Чтобы закрепить модификатор на подложке электрода, удаляется серная кислота посредством кратковременного погружения рабочей поверхности электрода в дистиллированную воду.

5. После этого электрод сушится до полного высыхания в сушильном шкафу при температуре не более 100°С.

Для уменьшения ошибки эксперимента, индикаторный электрод проходил предварительную поляризацию в области потенциалов: Е равно от +2 до -2 В, для PtCo(II) электрода в течение 5-10 мин, используя метод циклической вольтамперометрии.

В качестве электрода сравнения использовали хлоридсеребряный электрод.

Методика определения антиоксидантной активности экстрактов чаев

В электрохимическую ячейку помещали 10 см³ раствора фонового электролита. В качестве фонового электролита для водно-спиртовых сред использовали 0,1 моль/дм³ NaClO₄, растворенный в диметилформамиде. Для работы собирали трехэлектродную ячейку, состоящую из рабочего модифицированного платинового электрода, хлоридсеребряного электрода, используемого в качестве электрода сравнения, и вспомогательного хлоридсеребряный электрода. Электроды опускали в раствор фонового электролита и подключали к анализатору ТА-2 (ООО «НИП «Томаналит», Томск). Использовался постоянно-токовый режим катодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала составляла W=40 мВ/с, рабочий диапазон потенциалов - от 0 до -1,2 В. Перемешивали раствор с помощью вибрации электродов 20 сек, 10 сек - стадия успокоение раствора. Далее снимали первую волну катодного восстановления кислорода, растворенного в фоновом растворителе, в указанной области потенциалов. Повторяли съемку вольтамперограммы не менее трех раз. Делали добавки экстрактов чаев, каждый раз снимая вольтамперограммы первой волны катодного восстановления кислорода. По полученным результатам строили график зависимости относительного тока электровосстановления кислорода ( ) от времени взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными формами. По тангенсу угла наклона касательной к прямолинейному участку данной кривой проводили расчет кинетического (k_{кинетич.} (мкмоль/л·мин)) критерия антиоксидантной активности.

Кинетический критерий отражает количество активных кислородных форм, прореагировавших с антиоксидантами (или суммарным содержанием антиоксидантов) за минуту времени. Размерность: мкмоль/л·мин.

где I_i - ток электровосстановления О₂ в присутствии антиоксидантов в растворе, мкА;

I_O - ток электровосстановления О₂ в отсутствии антиоксидантов в растворе, мкА;

- исходная концентрация кислорода в растворе, мкмоль/л;

t - время реакции взаимодействия антиоксидантов с активными кислородными формами, мин.

Пример

В качестве объектов исследования были выбраны чаи: зеленый китайский, красный китайский, Оолонг, белый китайский, цветочный (прошедший частичную ферментативную обработку).

Пробоподготовка экстрактов чаев

Все чаи отдельно растирали до порошкообразного состояния в шарообразной мельнице, после чего экстрагировали 0,5 г измельченного чая в 25 мл экстрагента этанол:вода (70:30). Через 10 мин настои фильтровали. Для исследования антиоксидантной активности экстрактов чаев использовалась аликвота 1 мл.

Количественную оценку антиоксидантной активности экстрактов чаев проводили расчетным путем по формуле (1). Результаты определения антиоксидантной активности экстрактов чаев (k, мкмоль/(л·мин)) представлены в таблице 1.

Предложенный способ определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов чаев методом вольтамперометрии отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой экспрессностью и чувствительностью. Предложенный способ может быть использован для оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ.