РЕГИОСЕЛЕКТИВНОЕ АЦИЛИРОВАНИЕ РАПАМИЦИНА В ПОЛОЖЕНИИ С-42

Настоящее изобретение относится к ацилированию рапамицина, предпочтительно к региоселективному ацилированию рапамицина.

Рапамицин (1) является иммуносупрессивным лекарственным средством, использующимся для предупреждения отторжения трансплантата органа. Он представляет собой макролид, обладающий следующей формулой:

Рапамицин (1) является промежуточным продуктом для получения темсиролимуса, который представляет собой лекарственное средство, предназначенное для лечения почечноклеточной карциномы. Темсиролимус обладает следующей формулой:

Для получения темсиролимуса (2) рапамицин (1) необходимо ацилировать в положении 42.

В соответствии с WO 95/28406 A1 рапамицин можно ацилировать с помощью ацилирующего реагента, например, смешанного ангидрида 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновой кислоты с 2,4,6-трихлорбензойной кислотой в присутствии 4-диметиламинопиридина (ДМАП), но при этом выходы являются низкими. В соответствии с WO 2005/100366 A1 способ региоспецифичного получения сложного 42-эфира рапамицина включает реакцию рапамицина с активированным сложным эфиром в присутствии микробиальной липазы в эффективном количестве. В соответствии с US 2010/0249415 рапамицин можно ацилировать с использованием ангидрида 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновой кислоты в присутствии ДМАП; в публикации подчеркивается: "эффективное установление различия между этими двумя функциональными центрами, необходимое для обеспечения селективного синтеза 42-моноацилированного продукта, является чрезвычайно трудной задачей" - поэтому для обеспечения высокой селективности и низкого количества побочных продуктов разложения этот способ осуществляют при низких степенях превращения (<40%).

В соответствии с US-A-4316885 ацилпроизводные рапамицина получают путем добавления уксусного ангидрида к раствору рапамицина в пиридине. Однако выход искомого 42-ацетилпроизводного ниже выхода бис-ацилпроизводного, которое является нежелательным преобладающим продуктом.

В соответствии с US-A-5120727 хлорангидриды дикарбоновых кислот добавляют к растворам рапамицина в толуоле. И в этом случае выход и селективность получения искомого 42-ацилпроизводного являются низкими.

Известные способы не являются приемлемыми с точки зрения выхода, затрат и количества эквивалентов реагента.

Поэтому задачей настоящего изобретения является разработка способа ацилирования поликетидов макролактона, предпочтительно рапамицина, улучшенного с точки зрения выхода, затрат и/или количества эквивалентов реагентов. Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа ацилирования поликетидов макролактона с улучшенной региоселективностью.

При использовании в настоящем изобретении региоселективность означает, что химическое превращение протекает селективно по одной конкретной функциональной группе молекулы, в которой содержится более одной такой функциональной группы.

Настоящее изобретение относится к способу ацилирования рапамицина с помощью ацилирующего реагента формулы

в которой R⁴ и R⁵ являются одинаковыми или разными, по отдельности обозначают остаток ацеталя, предпочтительно тетрагидропиран, или остаток карбоната, или остаток простого силилового эфира, или взятые вместе обозначают остаток бороната, ацеталя или кеталя, предпочтительно кеталя формулы II

в которой R⁶ все независимо обозначают H, метил, этил, пропил, фенил или взятые вместе могут образовать циклобутановое, циклопентановое, циклогексановое, циклогептановое или циклооктановое кольцо, и X обозначает галоген, более предпочтительно F, Cl или Br, в присутствии основания, которым является пиридин, необязательно в присутствии дополнительного растворителя S.

В настоящем изобретении можно повысить степень превращения и селективность при ацилировании рапамицина. В особенности при ацилировании рапамицина в положении 42 обеспечивается высокая степень превращения в сочетании с высокой селективностью.

Для сравнения различных условий проведения ацилирования установлены следующие показатели:

Степень превращения означает отношение % площади 3/(% площади 3 + % площади 1).

Селективность означает отношение % площади 3/(% площади 3 + % площади 4).

Номера, выполненные жирным шрифтом, относятся к соединениям, определенным ниже в настоящем изобретении, и выраженная в % площадь означает площадь одного конкретного пика в пересчете на сумму площадей всех пиков на хроматограмме.

Выход означает количество чистого соединения, полученного после очистки и выделения, выраженное как отношение количество молей (продукт):количество молей (субстрат).

Термин субстрат означает химические соединения, за которыми следят в ходе проведения реакции, в настоящем изобретении им обычно является рапамицин или его производное.

Термин эквивалент означает отношение количества молей данного соединения к количеству молей субстрата.

Ацилирующие реагенты, применимые в настоящем изобретении, описываются формулой I. В одном варианте осуществления заместители в формуле I обладают следующими значениями:

R⁴, R⁵: обозначают кеталь формулы II

,

в которой

R⁶: все независимо обозначают H, метил, этил, пропил, фенил или взятые вместе могут образовать циклопентановое или циклогептановое кольцо, и

X: обозначает галоген, предпочтительно Br, F или, наиболее предпочтительно, Cl.

В предпочтительном варианте осуществления заместители обладают следующими значениями:

R⁴, R⁵: обозначают кеталь формулы

,

в которой

R⁶: обозначают метил, этил или взятые вместе образуют циклопентановое или циклогептановое кольцо, и

X: обозначает галоген, предпочтительно Br, F или, наиболее предпочтительно, Cl.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления ацилирующим реагентом является хлорангидрид 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновой кислоты (TMDC-Cl).

Использующимся основанием является пиридин.

Количество эквивалентов основания, использующего в способе, может составлять 1-10 экв., более предпочтительно 3-6 экв.

Ацилирование предпочтительно проводят в присутствии растворителей, предпочтительно органических растворителей, определенных как непротонные полярные растворители. Применимыми растворителями являются CH₂Cl₂, хлороформ, тетрагидрофуран, 2-метилтетрагидрофуран, диоксан, метилацетат, этилацетат, метилпропионат, этилпропионат, н-пропилацетат, изопропилацетат или их смеси. Пиридин можно использовать и в качестве основания, и в качестве растворителя.

Ацилирование можно провести при температуре в диапазоне от -5 до 20°C, предпочтительно от 2 до 8°C. Концентрация субстрата может составлять от 0,05 до 0,5 моля/(л растворителя), предпочтительно от 0,1 до 0,3 моля/(л растворителя). В предпочтительном варианте осуществления используют от 1,0 до 10 экв., предпочтительно от 2,0 до 3,0 экв. ацилирующего реагента.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ацилированию рапамицина в положении 42 с помощью хлорангидрида 2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоновой кислоты в присутствии пиридина в качестве основания, наиболее предпочтительно при температуре, равной от -5 до 20°C, особенно предпочтительно от 2 до 8°C.

Очистка соединения 3

Необязательную очистку ацилированного соединения 3 можно провести по стандартным литературным методикам, таким как колоночная хроматография и кристаллизация. Объектом настоящего изобретения является возможность получения продукта, обладающего чистотой >90%, с помощью кристаллизации продукта из смеси гептана и этилацетата. Кроме того, содержание бис-ацилированного побочного продукта составляет <4,0% и содержание исходного вещества составляет <0,05%.

Приведенное ниже описание предназначено для иллюстрации получения типичных соединений, предлагаемых в настоящем изобретении.

Приведенная выше схема представляет собой предпочтительный вариант осуществления, в котором чистота продукта 3 составляет >95%. В особенно предпочтительном варианте осуществления содержание соединения 4 составляет <2,0% и содержание соединения 1 составляет <0,05%.

Высокая степень чистоты/низкое содержание примесей в соединении, полученном на этой стадии ацилирования, является очень важным для обеспечения чистоты продуктов последующих реакций, полученных после удаления защитных групп. В особенности присутствие бис-ацилированного продукта приводит к наличию в продукте примесей, которые трудно удалить с помощью хроматографии и/или кристаллизации.

В другом варианте осуществления продуктом реакции кислого гидролиза (удаление защитной группы) соединения 3 является темсиролимус (2). Побочным продуктом, полученным при гидролизе соединения 4, является соединение, охарактеризованное, как 31-(2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоксилат)темсиролимус.

Очистка соединения 2

Необязательную очистку соединения 2 можно провести по стандартным лабораторным методикам, таким как колоночная хроматография и кристаллизация. Объектом настоящего изобретения является возможность получения продукта, обладающего чистотой >90%, с помощью кристаллизации продукта из смеси гептана и этилацетата. В предпочтительном варианте осуществления чистота составляет >95%. В особенно предпочтительном варианте осуществления содержание 31-(2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоксилат)темсиролимуса составляет <0,15%.

Для обеспечения еще более высокой чистоты можно использовать очистку с помощью пВЭЖХ (препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография) и получить продукт, обладающий чистотой >98%. С помощью указанной методики также можно удалить сопутствующий побочный продукт, образующийся при ферментации, 36-дезметил-36-этилтемсиролимус. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения содержание 36-дезметил-36-этилтемсиролимуса составляет <0,15% площади конечного продукта.

С учетом этих критериев для исследования различных условий проведения реакции использовали следующий эксперимент.

Пример 1: 42-Эфир рапамицина с 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновой кислотой (3)

1,00 г Рапамицина растворяли в 2-10 мл CH₂Cl₂ для обеспечения концентрации, указанной в таблице 1, и смешивали с реагентом и основанием в количествах, указанных в приведенной ниже таблице 1, и перемешивали и выдерживали при температуре, указанной в таблице 1. Смесь перемешивали в течение 3 дней или до тех пор, пока данные о протекании реакции не указывали на завершение превращения. Осадившиеся амингидрохлориды удаляли фильтрованием и фильтр промывали с помощью 20 мл CH₂Cl₂. Фильтрат промывали с помощью 20 мл воды, сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме и получали конечный продукт.

Использовали приведенные ниже ацилирующие реагенты, где TMDC означает 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновую кислоту:

Использовали следующие основания:

Параметры реакции и результаты приведены в представленной ниже таблице 1:

Преимущества

Для успешного протекания этой реакции критически важную роль играет и комбинация ацилирующего реагента, и основание. Например, важную роль комбинации TMDC-Cl с пиридином можно видеть при сравнении с данными, полученными при использовании других ацилирующих реагентов (таблица 1). В особенности использование 4,4-диметиламинопиридина (ДМАП), который использовали в предшествующем уровне техники, а также других оснований-аминов и их комбинаций приводит к намного более низкой селективности. Другим фактором, оказывающим влияние, является температура.

Из таблицы 1 видно, что наилучшие результаты для степени превращения и селективности получены в соответствии с настоящим изобретением.

Пример 2: 42-Эфир рапамицина с 2,2,5-триметил[1,3]диоксан-5-карбоновой кислотой (3)

В 3-горлую колбу объемом 500 мл помещали рапамицин (25 г, 25,98 ммоля) и добавляли 70 мл CH₂Cl₂. Затем раствор охлаждали до 5°C. В отдельном сосуде TMDC-Cl (12,51 г, 64,95 ммоля) разбавляли с помощью 28 мл CH₂Cl₂ и затем охлаждали до 5°C. Добавляли пиридин (9,73 г, 122,1 ммоля) и полученную смесь добавляли к раствору рапамицина. Затем полученную смесь перемешивали при 5°C в течение 24 ч, после этого данные ВЭЖХ о протекании реакции показывали, что превращение прошло на >97%.

Реакцию останавливали путем добавления раствора (NH₄)₂SO₄. Затем добавляли 200 мл EtOAc и двухфазную смесь концентрировали в вакууме. Добавляли 100 мл EtOAc и значение pH реакционной смеси доводили до равного 2 путем добавления 2 М раствора H₂SO₄. После перемешивания в течение 5 мин водный слой отделяли и отбрасывали. Затем органический слой промывали с помощью 50 мл раствора NaHCO₃ и 50 мл рассола. Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме и получали белое вспененное вещество.

Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на 660 г SiO₂ с использованием смеси гептан/этилацетат состава 1:1. Продукт концентрировали до объема, равного 1/3 исходного, после чего раствор становился мутным. Добавляли затравочные кристаллы, затем дополнительно концентрировали. Затем твердое вещество отфильтровывали и сушили в вакууме и получали 21 г (75%) соединения 3, обладающего чистотой >95%, содержащего в качестве примеси менее 2,0% соединения 4.

Пример 3: Темсиролимус (2)

18,3 г соединения 3 растворяли в 160 мл ТГФ (тетрагидрофуран). Полученный раствор охлаждали до 5°C. Затем добавляли 32 мл 2 М раствора H₂SO₄ и смесь перемешивали в течение 24 ч. Затем реакционную смесь нейтрализовывали путем добавления насыщенного раствора NaHCO₃ и экстрагировали с помощью всего 200 мл этилацетата. Затем органический слой промывали разбавленным вдвое насыщенным раствором NaCl, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме и получали белое вспененное вещество.

Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на 600 г SiO₂ с использованием смеси гептан/этилацетат состава 1:3. Продукт концентрировали до объема, равного 1/6 исходного, и в реакционный сосуд по каплям добавляли гептан до тех пор, пока раствор не становился мутным. Добавляли затравочные кристаллы, затем дополнительно добавляли гептан до обеспечения объема продукта, равного половине исходного. Затем твердое вещество отфильтровывали и сушили в вакууме и получали 12,85 г (73%) соединения 2.

При необходимости дополнительную очистку соединения 2 можно провести путем растворения в смеси гептан:этилацетат состава 65:35 с последующей обработкой с помощью пВЭЖХ на нормальной фазе силикагеля YMC SL06S11 с использованием в качестве подвижной фазы смеси гептан:этилацетат состава 65:35. Фракционирование элюата с использованием УФ-детектирования и последующее концентрирование, внесение затравки и добавление гептана дают соединение 2 в виде белого твердого вещества, которое можно выделить фильтрование, и получить 10,54 г (82%).

Настоящее изобретение также включает следующие варианты осуществления:

(1) Способ ацилирования рапамицина с помощью ацилирующего реагента формулы

в которой R⁴ и R⁵ являются одинаковыми или разными, по отдельности обозначают остаток ацеталя, предпочтительно тетрагидропиран, или карбоната, или остаток простого силилового эфира, или взятые вместе обозначают остаток бороната, ацеталя или кеталя, предпочтительно кеталя формулы II

в которой R⁶ все независимо обозначают H, метил, этил, пропил, фенил или взятые вместе могут образовать циклобутановое, циклопентановое, циклогексановое, циклогептановое или циклооктановое кольцо, и X обозначает галоген, более предпочтительно F, Cl или Br, в присутствии основания, которым является пиридин, необязательно в присутствии дополнительного растворителя S.

(2) Способ, соответствующий параграфу 1, в котором растворитель S выбран из группы, включающей CH₂Cl₂, хлороформ, тетрагидрофуран, 2-метилтетрагидрофуран, диоксан, метилацетат, этилацетат, метилпропионат, этилпропионат, н-пропилацетат, изопропилацетат или их смеси.

(3) Способ, соответствующий параграфу 1 или 2, в котором заместители в формуле I обладают следующими значениями:

R⁴, R⁵: обозначают кеталь формулы II

R⁶: все независимо обозначают H, метил, этил, пропил, фенил или взятые вместе могут образовать циклопентановое или циклогептановое кольцо

X: обозначает галоген, предпочтительно Br, Cl, F, или наиболее предпочтительно Cl.

(4) Способ, соответствующий любому из параграфов 1-3, в котором заместители в формуле I обладают следующими значениями:

R¹, R², R³: H

R⁴, R⁵: вместе обозначают группу формулы II

в которой R⁶ обозначает метил и X обозначает Cl.

(7) Способ, соответствующий по меньшей мере одному из предыдущих параграфов, в котором ацилирование проводят при температуре, равной от -5 до 20°C, предпочтительно при +5°C ± 3°C.

(8) Способ, соответствующий по меньшей мере одному из предыдущих параграфов, в котором используют от 1,0 до 10, предпочтительно от 2,0 до 3,0 молей ацилирующего реагента в пересчете на 1 моль соединения, которое необходимо ацилировать.

(9) Способ, соответствующий по меньшей мере одному из предыдущих параграфов, в котором рапамицин ацилируют в положении 42 с помощью хлорангидрида 2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоновой кислоты в присутствии пиридина.

(10) Способ, соответствующий по меньшей мере одному из предыдущих параграфов, с помощью которого получают кристаллический 42-TMDC-RAPA, обладающий чистотой >95%.

(11) Способ, соответствующий параграфу (10), в котором содержание 31,42-TMDC-RAPA составляет <2,0% и содержание рапамицина составляет <0,05%.

(12) Способ синтеза темсиролимуса с использованием 42-TMDC-RAPA, полученного способом, определенным по меньшей мере в одном из предыдущих параграфов.

(13) Темсиролимус, который получен или может быть получен в соответствии со способом, соответствующим по меньшей мере одному из параграфов 10-12.

(14) Темсиролимус, содержащий менее 0,15% площади 31-(2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоксилат)темсиролимуса.

(15) Темсиролимус, содержащий менее 0,15% площади 36-дезметил-36-этилтемсиролимуса.