Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПОУГ С НЕЭФФЕКТИВНЫМ МЕСТНЫМ ГИПОТЕНЗИВНЫМ ЛЕЧЕНИЕМ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм офтальмопатологии, имеющая большое медико-социальное значение ввиду постоянного роста заболеваемости, высокой распространенности и тяжести исходов заболевания, ведущего к слепоте и инвалидности. Среди причин неустранимой слепоты в России глаукома занимает одно из ведущих мест, превышая среднеевропейский показатель в 1,5-2 раза [Либман E.С. Эпидемиологическая характеристика глаукомы /Либман E.С. //Глаукома. - 2009. - №1 (Прил.). - С.2-3]. Первичная открытоугольная глаукома (далее ПОУГ) - это форма глаукоматозного процесса, встречающаяся наиболее часто [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство /под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.]. ПОУГ является мультифакториальным заболеванием, в этиопатогенезе которого важная роль принадлежит полифункциональным цитокинам - факторам роста, регулирующим продукцию внеклеточного матрикса, влияющим на ангиогенез, пролиферацию и апоптоз клеток [Banerjee D. Comprehensive analysis of myocilin variants in east Indian POAG patients /Banerjee D., Bhattacharjee А., Ponda А., Ray K. //Molecular Vision. - 2012. Vol.18. - P.1548-1557].

Одним из ключевых механизмов развития глаукомной оптической нейропатии (далее ГОН) является дисрегуляция кровотока зрительного нерва. В ответ на тканевую гипоксию, эндотелиальные клетки секретируют проангиогенные факторы, такие как фактор роста сосудистого эндотелия - VEGF-А и рецептор инсулиноподобного фактора роста - IGFR-1. Этот процесс стимулирует каскад, ведущий к активации апоптоза ганглиозных клеток сетчатки [Resch H. Endothelial dysfunction in glaucoma. /Resch H., Garhofer G., Fuchsjager-Mayrl G. //Acta Opthalmologica. - 2009. - vol. 87. - P.4-12].

Повышенное внутриглазное давление (далее ВГД) является одним из ведущих факторов риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии [Куроедов А.В. Факторы риска прогрессирования первичной открытоугольной глаукомы. /Куроедов А.В., Городничий В.В. //Глаукома: теории, тенденции, технологии: Сб. науч. статей VI межд. конф. - М., 2008. - С. 370-385]. ПОУГ относится к необратимой патологии, стабилизация процесса зависит от своевременного лечения. В случаях, когда местное гипотензивное лечение ПОУГ неэффективно, ВГД выше толерантного, необходимо переходить к хирургическому лечению. Таким образом, чем раньше будет произведена нормализация ВГД, в т.ч. хирургическим способом, тем больше вероятность сохранения зрительных функций [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство /под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.].

Рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 IGFR-1 является продуктом экспрессии гена, расположенного у человека на дистальном участке длинного плеча 15 хромосомы, структурно схож с геном рецептора инсулина и состоит из 22 экзонов. Ген рецептора IGF-1 экспрессируется практически во всех тканях [Baserga R. The IGF-1 receptor in cancer biology. /Baserga R., Peruzzi F., Reiss K. //Int. J. Cancer. - 2003. - Vol.107. - P. 873-877].

Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF-A представляет собой гепаринсвязывающий гликопротеин молекулярной массой 45 кДа - это специфический митоген эндотелиальных клеток, являющийся стимулятором физиологического и патологического ангиогенеза, роста и пролиферации эндотелиоцитов, подавляет апоптоз циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток [Ferrara N. The biology of VEGF and its receptors /Ferrara N., Gerber H.P., Le Couter J. //Nat. Med. - 2003. - Vol.9(6). - P.669-76].

Ген VEGF-А находится на коротком плече 6 хромосомы в локусе 6p21.3 состоит из восьми экзонов, разделенных семью интронами, имеющих альтернативный сплайсинг, и контролирует синтез целой группы белков. Экспрессия гена VEGF-А модулируется различными факторами, в частности цитокинами, липополисахаридами, гормонами и гипоксией. Экспрессия VEGF-А весьма вариативна, описано не менее 25 различных полиморфизмов, которые ее определяют [Heist R. VEGF polymorphisms and survival in early-stage non-small cell lung cancer. /Heist R., Zhai R., Liu G. //Journal of clinicаl oncology. - 2008. - Vol.26. - P.856-62].

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: Способ прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением.

За прототип выбран метод изучения вовлеченности генетических вариантов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование ПОУГ в группе больных с некомпенсированным ВГД на фоне консервативного лечения, изложенный в диссертации Тикуновой Е.В. «Роль генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в развитии первичной открытоугольной глаукомы». В ходе данного исследования проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в формирование заболевания в группе больных ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне консервативной терапии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья. Консервативная терапия включала в себя назначение инстилляций различных групп препаратов: аналоги простагландинов, β-блокаторы, ингибиторы карбоангидразы, агонисты α₂-адренорецепторов, в виде монотерапии или их комбинаций. Некомпенсированным ВГД считался уровень офтальмотонуса выше толерантного давления - верхняя граница индивидуальной нормы ВГД [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство /под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.].

К недостаткам данного способа относится то, что он не учитывает роль генетических полиморфизмов факторов роста в формировании риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Задачей настоящего исследования являлось расширение арсенала способов диагностики ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением включающий:

• выделение ДНК из периферической венозной крови;

• анализ полиморфизмов генов VEGF-A с.-958C>T (rs 833061), IGFR-1 g.99181663 C>T (rs 4965425);

• прогнозирование повышенного риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением в случае выявления генетического варианта T IGFR-1 либо комбинации аллеля С VEGF-A с аллелем Т IGFR-1.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением по данным о генетических вариантах локусов VEGF-A с.-958C>T (rs 833061), IGFR-1 g.99181663 C>T (rs 4965425) и их сочетаний.

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах.

На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу VEGF-A с. -958C>T (rs 833061), где - CС VEGF-A, - ТТ VEGF-A, - СТ VEGF-A, - отрицательный контроль.

На фиг. 2 представлена дискриминация аллелей по локусу IGFR-1 g.99181663C>T (rs 4965425), где - CС IGFR-1, - ТT IGFR-1, - СТ IGFR-1, - отрицательный контроль.

На фиг. 3 в таблице 1 представлена сравнительная оценка частот аллелей и генотипов полиморфизмов факторов роста у пациентов ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и в контрольной группе.

На фиг. 4 в таблице 2 представлена распространенность сочетаний аллелей/генотипов генов факторов роста у больных ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и в контрольной группе.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе 4 мл крови смешивают с лизирующим буфером, в котором содержится 320 г сахарозы, 1% тритон Х - 100, 5 мл MgCl₂, 10 мл трис - HCl (pH=7,6), центрифугируют 20 минут при температуре 4ºС на 4000 об/мин. Далее добавляют 4 мл ЭДТА - Soline, 400 мкл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют в течение 16 ч при 40ºС.

На втором этапе из уже очищенного лизата производят экстракцию ДНК равными долями фенола, фенол-хлороформа, хлороформа и центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования водный слой удаляют и добавляют два объема охлажденного этанола 96%. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде, хранят при температуре -20°С и в дальнейшем используют для проведения полимеразной цепной реакции.

Анализ генетических полиморфизмов VEGF-A с.-958C>T, IGFR-1 g.99181663C>T осуществляют методом ПЦР синтеза ДНК, который проводят на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, USA) с использованием олигонуклеотидных зондов и праймеров для полимеразной цепной реакции фирмы «Синтол». Генотипирование осуществляют с использованием программного обеспечения «CFX Manager™».

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития первичной открытоугольной глаукомы с неэффективным местным гипотензивным лечением подтверждает анализ результатов наблюдений пациентов ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением - 162 человек (227 глаз) и 191 человек (382 глаза) контрольной группы. Формирование выборок больных и контроля осуществлялись на базе офтальмологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа и медицинского центра микрохирургии глаза ООО «Ковчег».

Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. В группу больных включались пациенты пациентов ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением. Некомпенсированным ВГД считался уровень офтальмотонуса выше толерантного давления при использовании максимально возможных комбинаций гипотензивных препаратов [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство /под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.]. Единицей исследования при данном анализе являлся глаз [Слепова O.С. Маркеры Fas-опосредованного апоптоза при первичной открытоугольной глаукоме и возможности их фармакологической коррекции /O.С. Слепова, М.А. Фролов, Н.С. Морозова, Дж.Н. Ловпаче //Вестник офтальмологии. - 2012. - №4. - С.27-31].

Группа контроля была сформирована из индивидуумов, не имеющих острых и хронических заболеваний глаз, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также они не имели тяжелых соматических патологий, в том числе приводящих к поражениям глаз.

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Изучение роли комбинаций генетических вариантов VEGF-A с.-958C>T, IGFR-1 g.99181663C>T в формирование ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением проводилось с помощью программного обеспечения APSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику. Для валидации найденных ассоциаций использовался точный критерий Фишера (p_f) и пермутационный анализ (p_perm). Значение p_perm для аллеля или аллельного сочетания определяется как вероятность того, что после сбалансированного перемешивания меток «больной ПОУГ» - «контроль» (100 пермутаций) и нового поиска с помощью APSampler оценка значимости ассоцииации с ПОУГ произвольно найденного аллеля или аллельного сочетания будет не хуже, чем эта оценка для исходного [Царева E.Ю. Фармакогеномные исследования эффективности лечения рассеянного склероза иммуномодулирующими препаратами: диссертация... кандидата биологических наук: 03.01.03 /Царева Екатерина Юрьевна //- Москва, 2012. - 140 с.]. Значимыми считали различия сравниваемых частот если p_f<0,05 и p_perm ≤ 0,005, при условии, что значения 95% CI для OR не пересекают 1.

Установлена более высокая концентрация аллеля T IGFR-1 (rs 35767) (63,06%) у больных ПОУГ по сравнению с группой контроля, где анализируемый показатель составил 56,02% (χ²=4,47, p=0,03, OR=1,34; 95% CI 1,02-1,76) (фиг. 3).

При проведении комплексного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов установлено, что концентрация сочетания аллеля С VEGF-A и аллеля Т IGFR-1 среди больных ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (67,82%) выше, чем среди контрольной группы (52,60%, P_perm=0,0003) (фиг. 4). Данное сочетание аллелей исследуемых полиморфизмов повышает риск развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (OR=1,90, 95% CI 1,29-2,80).

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что генетический вариант Т IGFR-1 и сочетание аллей С VEGF-A с Т IGFR-1 являются факторами риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения.

1. У пациента А., уроженца Центрального Черноземья РФ русской национальности, стоящего на учете по глаукоме и использующего местное медикаментозное лечение, обнаружено, что несмотря на применяемое лечение - ВГД повышено, т.е. местное гипотензивное лечение неэффективно. В дальнейшем у пациента был выявлен генетический вариант Т IGFR-1 (rs 4965425). Этому пациенту была рекомендована антиглаукотамозная операция.

2. У индивидуума В., уроженца Центрального Черноземья РФ русской национальности, страдающего ПОУГ, было выявлено сочетание генетических вариантов С VEGF-A (rs 833061) и Т IGFR-1 (rs 4965425). Он применял местное лечение комбинациями гипотензивных препаратов, однако ВГД было интоллерантным. В дальнейшем ему было проведено хирургическое лечение глаукомы.