СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРЕЭКЛАМПСИИ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в акушерстве и гинекологии для прогнозирования вероятности риска возникновения преэклампсии (далее ПЭ).

Преэклампсия или гестоз - это осложнение гестационного процесса, проявляющееся полиорганной и полисистемной недостаточностью, в основе которой лежат расстройства функций центральной и вегетативной нервной, сердечно-сосудистой, эндокринной систем, а также нарушения микроциркуляции, обменных процессов, иммунного ответа и других функций организма [Сидорова, И.С. Эндотелиальная дисфункция в развитии гестоза [Текст]. / И.С. Сидорова, И.Л. Галинова // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2006. - Т. 5, №1. - С. 75-81; Characterization of five marker levels of the hemostatic system and endothelial status in normotensive pregnancy and pre-eclampsia [Text]. / М. Hayashi, T. Inoue, K. Hoshimoto [et al.] // Eur. J. Haematol. - 2007. - Vol. 69, №5-6. - P. 297-302].

ПЭ характеризуется триадой типичных клинических симптомов: артериальной гипертензией, протеинурией, отеками, а также глубокими расстройствами функции сосудистой системы, гемостаза, иммунитета, гемодинамики и микроциркуляции, фетоплацентарной недостаточностью, нарушением функции почек, печени, легких, по сути, при тяжелых формах преэклампсии развивается тяжелая полиорганная недостаточность и эндогенная интоксикация.

Частота преэклампсии практически не снижается на протяжении последних двадцати лет и составляет по данным разных авторов 7-20% [Novel approaches for mechanistic understanding and predicting preeclampsia [Text]. / S. Kalkunte, Z. Lai, W. Norris [et al.] // J. Reprod. Immunol. - 2009. - Vol. 83, №1-2. - P. 134-138; Качалина, Т.С. Антиоксидантная терапия плацентарной недостаточности при гестозе [Текст]. / Т.С. Качалина, Н.В. Лебедева, Л.Н. Ильина // Практическая медицина. - 2010. - №43. - С. 98-99; Радзинский, В.Е. Иммунохимическая оценка перинатального риска [Текст]. / В.Е. Радзинский, С.Г. Морозов, Л.А. Чугунова // Вестник Российского университета дружбы народов. Сер. Медицина. - 2010. - №5. - С. 7-12].

В настоящее время к факторам риска возникновения данной патологии беременности относятся: преэклампсия при предыдущей беременности, возраст, первая беременность, многоплодие, генетические факторы, социальные аспекты, профессиональные вредности, вредные привычки, неудовлетворительная экологическая обстановка, недостаточное и несбалансированное питание, осложненный акушерско-гинекологический анамнез, воспалительные заболевания гениталий, которые, как правило, сочетаются с поражением мочевыводящих путей, патология сосудистой системы [Сидорова, И.С. Эндотелиальная дисфункция в развитии гестоза [Текст]. / И.С. Сидорова, И.Л. Галинова // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2006. - Т. 5, №1. - С. 75-81; Айламазян Э.К., Мозговая Е.В. [Текст] Гестоз: теория и практика. М.: МЕДпресс-информ, 2008. 272 с.; Risk factors for a prolonged length of stay in women hospitalized for preeclampsia in Texas. / Z.D. Mulla, B.S. Nuwayhid, К.M. Garcia [et al.] [Text] // Hypertens Pregnancy. 2010. Vol. 29, №1. P. 54-68].

В настоящее время известно свыше 30 генов-кандидатов преэклампсии. Локальные генные сети преэклампсии включают гены метаболизма, гены эндотелиальной дисфункции, гены сосудистой системы, гены ростовых факторов и цитокинов, гены эндокринной системы, гены главного комплекса гистосовместимости [Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины [Текст]: [коллектив. моногр. / В.С. Баранов, А.С. Глотов, Т.Э. Иващенко и др.]; под ред. В.С. Баранова. - Санкт-Петербург: Изд-во Н-Л, 2009. - 527 с.: ил.]. К настоящему времени выявлены ассоциации различных генетических полиморфизмов с преэклампсией [A low СОМТ activity haplotype is associated with recurrent preeclampsia in a Norwegian population cohort (HUNT2) [Text]. / L.T. Roten, M.H. Fenstad, S. Forsmo [et al.] // Mol. Hum. Reprod. - 2011. - Vol. 17, №7. - P. 439-446; Young, В.C. Pathogenesis of preeclampsia [Text]. / В.C. Young, R.J. Levine, S.A. Karumanchi // Annu Rev. Pathol. - 2010. - Vol. 5. - P. 173-192].

Ген CYP11B2 расположен на хромосоме 08q21. Был исследован полиморфизм, связанный с заменой в промоторе цитозина на тимин в положении - 344 (- 344С/Т CYP11B2).

С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска возникновения ПЭ на основании исследованных полиморфных вариантов генов вазоактивных гормонов и других возможных факторов риска с целью выявления беременных, предрасположенных к преэклампсии.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования низкого риска преэклампсии на основе данных о полиморфизме гена вазоактивных гормонов - 344С/Т CYP11 B2 в сочетании с другими предикторами развития данного осложнения беременности.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования развития преэклампсии на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов.

Известен патент РФ №2478960 по заявке РФ №2011116693/15, 28.04.2011 «СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕСТОЗА У БЕРЕМЕННЫХ» (Лапина Владлена Георгиевна (RU), Качалина Татьяна Симоновна (RU), Каткова Надежда Юрьевна (RU)). Способ включает забор крови и определение содержания неоптерина в сыворотке крови в сроки 16-18 недель гестации. Недостаток метода заключается в сложности анализа, его неспособности диагностировать ПЭ при прегравидарной подготовке.

Наиболее близкое техническое решение известно из статьи «АССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ПЛАЦЕНТЫ У БЕРЕМЕННЫХ С ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ» (Елыкова А.В.) // Журнал «Медицина и образование в Сибири», №5, 2012, http://ngmu.ru/cozo/mos/article/pdf.php?id=802, в котором описан способ ассоциации молекулярно-генетических маркеров с морфологическими характеристиками плаценты у беременных женщин русской национальности, которые являются уроженками Центрально-Черноземного региона России, путем забора венозной крови, выделения геномной ДНК, проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и исследование гена CYP11B2, в результате которого установлено, что фактором риска развития легкой степени тяжести преэклампсии является генотип - 344ТТ CYP11B2.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования вероятности риска возникновения по данным о генетическом полиморфизме - 344С/Т CYP11 B2 в сочетании с другими предикторами развития данного осложнения беременности.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки вероятности риска возникновения преэклампсии.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования вероятности риска возникновения преэклампсии, включающий:

- забор крови;

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- исследование гена CYP11B2;

- анализ полиморфизма гена - 344С/Т CYP11 B2;

- прогнозирование вероятности риска возникновения ПЭ у беременных в зависимости от выявленного варианта по локусу - 344С/Т CYP11 B2 в сочетании с такими предикторами развития данного осложнения беременности, как наличие ПЭ у родственников, систолическое артериальное давление (далее САД) до беременности, курение, наличие патологии со стороны сердечно-сосудистой системы;

- прогнозирование вероятности риска возникновения преэклампсии по результатам уравнения

P=e^y/(1+e^y),

где P - вероятность возникновения преэклампсии,

e - математическая константа, равная 2,72,

y находят из уравнения бинарной логистической регрессии следующего вида:

y=16,462+0,820*x₁+0,680*x₂-2,470*x₃-2,444*x₄-0,132*x₅,

где x₁ - генетический вариант по локусу - 344С/Т CYP11 B2, а именно СС или ТС - 1, ТТ - 0;

x₂ - курение: да - 0, нет - 1;

x₃ - наличие ПЭ у родственников: да - 0, нет - 1;

x₄ - наличие патологии со стороны сердечно-сосудистой системы: да - 0, нет - 1;

x₅ - САД до беременности, мм рт.ст.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза вероятности риска возникновения преэклампсии у беременных по наличию генетического варианта локуса - 344С/Т CYP11 B2 в сочетании с такими предикторами развития данного осложнения беременности, как наличие ПЭ у родственников, САД до беременности, курение, наличие патологии со стороны сердечно-сосудистой системы.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови пациентки в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.

Анализ локуса CYP11B2 (rs1799998) проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров (табл. 1).

Структура и температура отжига праймеров, концентрация MgCl₂, ферменты рестрикции, использованные для генотипирования ДНК-маркеров методами ПЦР

Реакцию осуществляют в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 тмМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°C) выполняют 35 циклов амплификации по схеме: денатурация - 1 мин при 95°C; отжиг праймеров - 1 мин при 63°C; элонгация - 1 мин при 72°C. Затем пробы выдерживают 6 мин при 72°C и охлаждают. Продукты амплификации визуализируют в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%), в течение 20 минут при 200 V. В качестве электрофорезного буфера используют трис-ацетатный буфер 1хТА. Затем пробы идентифицируют в проходящем УФ-свете.

Амплификат, наработанный при ПЦР, подвергают рестрикции путем добавления к 12,5 мкл амплификата 5 ед. активности эндонуклеазы рестрикции Нае III "СибЭнзим"и инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 16 часов.

Продукты ПДРФ-анализа оценивают путем разделения при помощи электрофореза в 3%-ном агарозном геле, в течение 1 ч при 120 V. Визуализацию фореграмм осуществляют в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Аллелю -344С соответствуют фрагменты длиной 118, 81 и 71 п. н. Фрагменты длиной 189 и 81 п. н. соответствуют аллелю -344Т (фиг. 1).

Изобретение характеризуется фиг. 1, на которой представлен результат электрофоретического разделения продуктов рестрикции гена альдостеронсинтазы -44С/Т CYP11B2, где 2, 12 - гомозигота по аллелю -344С; 1, 4, 7, 8, - гомозигота по аллелю -344Т; 3, 5, 6, 9-11 - гетерозигота -344СТ.

Возможность использования предложенного способа для оценки вероятности риска возникновения преэклампсии подтверждает анализ результатов обследования 452 женщин: 249 беременных с диагнозом ПЭ и контрольная группа из 209 женщин с нормальным течением беременности.

В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрально-Черноземного региона России и не имеющие родства между собой. Средний возраст основной группы 27,11±6,42 лет (варьировался от 18 до 44 лет), в контрольной - 26,5±6,36 года (варьировался от 18 до 42 лет) (p>0,05). Таким образом, группа популяционного контроля не отличалась от основной группы по возрасту, полу, национальности и месту рождения.

Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводились на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после, связанной с ПЭ, для научно-исследовательских целей, и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Прогнозирование вероятности риска возникновения ПЭ осуществлялось с использованием дискриминантного анализа [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст]. / О.Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.: ил.; Боровиков, В.П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст]. / В.П. Боровиков. - 2-е изд. - Санкт-Петербург: Питер, 2003. - 688 с.].

На первом этапе данного исследования методом бинарной логистической регрессии построена статистическая модель прогнозирования вероятности риска возникновения преэклампсии с учетом более двадцати пяти признаков, характеризующих медико-биологический статус женщин до беременности (возраст возникновения беременности, показатели артериального давления, отягощенность соматопатологией, семейный анамнез и др.), наличие вредных привычек (курение, алкоголь) и генетические характеристики по исследуемому локусу вазоактивных гормонов. Среди всех оцененных моделей наиболее прогностически ценным в отношении риска возникновения ПЭ была модель, включающая следующие предикторы: курение, наличие ПЭ у родственников, наличие патологии сердечно-сосудистой системы, систолическое артериальное давление до беременности, генетический вариант по локусу -344С/Т CYP11 B2. Параметры логистической регрессионной модели представлены в таблице 2.

Уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения ПЭ. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляет 12,43, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения i-го признака шанс возникновения ПЭ увеличивается более чем в 12 раз. Указанная модель корректно предсказывает в 87% случаев вероятность возникновения ПЭ и в 64% случаев правильно классифицирует здоровых индивидуумов.

Логистическая регрессионная модель прогнозирования вероятности риска возникновения преэклампсии

Конкретные примеры использования заявленного способа.

Пример 1. У беременной пациентки Е. русской национальности, являющейся уроженкой Центрально-Черноземного региона России, определены следующие показатели: курение - нет, наличие патологии сердечно-сосудистой системы - да, наличие ПЭ у родственников - да, САД до беременности - 120 мм рт.ст., генетический вариант локуса -344С/Т CYP11 В2 - ТТ. Подставив значения в уравнение регрессии, получим для беременной Е.:

y=16,462+0,820*0+0,680*1-2,470*0-2,444*0-0,132*120=1,3,

соответственно P=2,72^1,3/(1+2,72^1,3)=0,78, т.е. вероятность риска возникновения ПЭ у беременной Е. высока. Дальнейшее обследование беременной Е. выявило у нее преэклампсию.

Пример 2. У беременной пациентки В. русской национальности, являющейся уроженкой Центрально-Черноземного региона России, были определены следующие показатели: курение - да, наличие патологии сердечно-сосудистой системы - нет, наличие ПЭ у родственников - нет, САД до беременности - 120 мм рт.ст., генетический вариант локуса -344С/Т CYP11B2 - СС. Подставив значения в уравнение регрессии, получим для беременной В.:

y=16,462+0,820*1+0,680*0-2,470*1-2,444*1-0,132*120=-3,472,

соответственно P=2,72^-3,472/(1+2,72^-3,472) или (1/2,72^3,472)/1+(1/2,72^3,472)=0,03, т.е. вероятность риска возникновения ПЭ у пациентки В. крайне мала. При дальнейшем клиническом и клинико-лабораторном обследовании этой беременной преэклампсии выявлено не было.

Таким образом, можно заключить, что предложенный способ позволяет эффективно прогнозировать вероятность риска возникновения преэклампсии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, что позволит улучшить качество прегравидарной подготовки женщин и будет способствовать эффективной реализации своевременных лечебно-профилактических мероприятии по предупреждению формирования ПЭ.