Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы у женщин с генитальным эндометриозом.
Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов цитокинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции цитокинов, что может влиять на развитие пролиферативных процессов в организме.
Эндометриоз - это патологический процесс, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобное эндометрию [1, 2]. В структуре гинекологической заболеваемости генитальный эндометриоз прочно удерживает третье место после воспалительных заболеваний и миомы матки. Эндометриоз приводит к значительным нарушениям репродуктивной функции, стойкому болевому синдрому, а в тяжелых случаях - к нарушению функции смежных органов и инвалидизации [2, 3, 4].
Согласно данным литературы, генитальный эндометриоз рассматривают как гормонозависимую патологию [5, 6]. Развитие генитального эндометриоза происходит на фоне нарушений функционирования гипоталамо - гипофизарно - яичниковой системы, к которым относится недостаточность желтого тела, синдром неовулирующего фолликула и др., что может привести к возникновению патологических состояний в молочных железах у больных эндометриозом [2]. Доброкачественная дисплазия молочной железы - это доброкачественное заболевание молочной железы, проявляющееся в патологическом разрастании ее тканей.
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии доброкачественной дисплазии молочной железы и эндометриоза играют цитокины, обладающие апоптотическим и пролиферативным действием.
Апоптоз - это особая разновидность гибели клеток, регулируемая на генно-молекулярном уровне, позволяющая сохранить генетически запрограммированное постоянство числа клеток для каждой ткани (органа) на протяжении жизни человека. Путем апоптоза удаляются только атипичные, постаревшие, больные, зараженные вирусом клетки [7]. Согласно данным литературы [8], рецептор фактора некроза опухоли 1-го типа участвует в реализации TNF зависимого апоптоза, усиливая его выраженность.
Известен «Способ прогнозирования опухолевых заболеваний молочной железы», который характеризуется тем, что проводят высокоселективную твердофазную экстракцию пробы мочи с последующим качественным и количественным определением содержания в моче следующих нуклеозидов: 1-метиладенозина (Z1), уридина (Z2), ксантозина (Z3), 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) (Z4), цитидина (Z5) и NN-диметилгуанозина (Z6), при этом вероятность наличия патологии молочной железы возрастает в случае увеличения количественного содержания в моче уридина, ксантозина, 5-дезокси-5-метилтиоаденозина (МТА) и цитидина и уменьшения количественного содержания 1-метиладенозина и NN-диметилгуанозина, а оценку вероятности наличия патологии молочной железы рассчитывают путем определения значения прогнозирующей функции F по формуле [9].
Известен «Способ прогнозирования течения доброкачественных заболеваний молочной железы и пролиферативной мастопатии», в котором по содержанию продуктов окисления NO в крови определяют содержание нитрат-ионов в цельной крови и при снижении их концентрации ниже 1,404 ммоль/л прогнозируется высокий риск малигнизации дисгормональных заболеваний молочной железы и пролиферативной мастопатии [10].
Известен «Способ прогнозирования характера поражения матки миоматозными узлами» у больной миомой матки, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генотипов локуса+36 A/G рецептора фактора некроза опухоли 1 типа TNFR1, прогнозирование характера поражения матки миоматозными узлами, включая площадь и объем узлов, а также размер матки, причем при выявлении генотипов+36 GG и+36 AG TNFR1 прогнозируют наименьшую степень поражения матки, при выявлении генотипа+36 АА TNFR1 прогнозируют наибольшую степень поражения матки [11].
Недостатком известных способов является то, что они не решают задачу прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе и являются трудоемкими для практического применения.
В изученной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено способа прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе на основе данных о полиморфизме гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа, следовательно, предложенный способ отвечает критерию новизна.
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе на основании выявления полиморфных маркеров гена рецептора 1-го типа TNFα.
Технический результат - получение критериев прогноза риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе, позволяющих в кратчайшие сроки определить тактику ведения больных с данной патологией.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы у женщин с генитальным эндометриозом, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови, определении полиморфизма гена рецептора 1-го типа TNFa (+36 A/G TNFR1), прогнозировании риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе в зависимости от выявленного генотипа: больные генитальным эндометриозом в случае выявления генотипов +36 АА и +36 AG рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (TNFR1) имеют высокий риск развития доброкачественной дисплазии молочной железы.
Этим больным следует рекомендовать динамический контроль состояния молочных желез (с использованием ультразвукового и рентгенологического методов исследования) с целью раннего выявления и своевременного лечения доброкачественной дисплазии молочной железы у больных генитальным эндометриозом.
Таким образом, предложенный способ определения риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе по наличию маркеров локуса +36 A/G TNFR1 явным образом не следует для специалиста из известного уровня техники, следовательно, способ обладает изобретательским уровнем.
Способ осуществляют следующим образом: ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных генитальным эндометриозом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (рН 7,6). Полученную смесь перемешиввют и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут.
После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Нуклеотидная последовательность типируемого локуса+36A/G TNFR1 включает 60 п.н. [www.ncbi.nlm.nih.gov] и представлена следующим образом: agcccactct tccctttgtc cctggtctca ccag[t]ggcag cag caggtca ggcacggtgg, где жирным шрифтом выделены прямой и обратный праймеры, подчеркиванием выделен зонд, [ t ] - указано место замены.
Анализ локуса+36 A/G TNFR1 осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием полимеразы Thermus aquaticus, производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Структура праймеров и зондов, использованных для генотипирования ДНК-маркеров методом ПЦР, представлены в таблице 1.
|
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфного локуса +36 A/G TNFR1 выполняется в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 52°С; денатурация - 15 сек при 95°С.
При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе IQ5) генотипирование осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствовал аллелю G, зонд с красителем FAM -аллелю А.
Дискриминация аллелей по локусу +36A/G TNFR1 представлена на Фиг.1, где обозначены:
• - гомозиготы 36АА TNFR1;
▪ - гомозиготы 36GG TNFR1;
▲ - гетерозиготы 36AG TNFR1;
♦ - отрицательный контроль.
Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей:
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (AG).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси х).
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0». Взаимосвязи между клинико-патогенетически значимыми признаками генитального эндометриоза и полиморфизмом гена рецептора 1-го типа фактора некроза опухоли α оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI).
Возможность использования предложенного способа для определения прогноза развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе подтверждает анализ результатов наблюдений 232 больных генитальным эндометриозом и 248 женщин контрольной группы. Пациентки включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью лабораторно-инструментальных и гистологических методов обследования (возраст варьировал от 18 до 60 лет, средний возраст составил 36,8±8,5 лет). Контрольную группу составили 248 практически здоровых женщин в возрасте от 20 до 60 лет (средний возраст 41,2±7,5 лет), отобранных по национальному составу (русские) и месту рождения (уроженки Центрального Черноземья) соответственно группе больных генитальным эндометриозом. Таким образом, группа популяционного контроля не отличалась от группы больных по полу, возрасту (р>0,05), месту рождения и национальности.
Проведен анализ распределения исследуемых молекулярно-генетических маркеров у женщин с генитальным эндометриозом в зависимости от его сочетания с доброкачественной дисплазией молочной железы. Выявлено, что в исследуемой нами группе из 232 пациенток с эндометриозом доброкачественная дисплазия молочной железы встречалась у 51 женщины (22,0%).
При анализе распределения генетического полиморфизма +36 A/G TNFR1 среди исследуемых групп женщин установлено, что пациентки с генитальным эндометриозом, сочетающимся с доброкачественной дисплазией молочной железы, отличаются более высокой (в 1,2 раза) частотой генотипов +36 АА и +36 AG рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (89,8%) по сравнению как с женщинами с эндометриозом без доброкачественной дисплазии молочной железы (71,3%, χ2=6,1, р=0,01), так и с популяционным контролем (73,2%, χ2=5,3, р=0,02). Частота генотипов +36 АА TNFR1 и +36 AG TNFR1 в группах больных генитальным эндометриозом в зависимости от наличия доброкачественной дисплазии молочной железы и в контрольной группе, в (%), представлена на Фиг.2. Следует отметить, что отношения шансов развития доброкачественной дисплазии молочной железы у больных генитальным эндометриозом при наличии генетических маркеров +36 АА TNFR1 и +36 AG TNFR1 составляет OR=3,2 при доверительном интервале 95% CI 1,16 - 9,68.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что молекулярно-генетическим маркером развития генитального эндометриоза, сочетающегося с доброкачественной дисплазией молочной железы, являются генотипы +36 АА TNFR1 и +36 AG TNFR1 рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (фактор риска OR=3,2).
Список литературы
1. Missmer S.A. The epidemiology of endometriosis [Text] / S.A.Missmer, D.W.Cramer // Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. - 2003. - Vol.30, is.1. - P.1-19.
2. Адамян Л.В. Эндометриозы [Текст]: руководство для врачей / Л.В.Адамян, В.И.Кулаков, Е.Н.Андреева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2006. - 416 с.
3. Баскаков В.П. Эндометриоидная болезнь [Текст] / В.П.Баскаков, Ю.В.Цвелев, Е.Ф.Кира. - СПб.: Изд-во Н-Л, 2002. - 448 с.
4. Association between polymorphism in the progesterone receptor gene and endometriosis [Text] / S.A.Treloar, Z.Z. Zhao Z.Z., T.Armitage [et al.] // Mol Hum Reprod. - 2005. - Vol.11, №9. - P.641-647.
5. Айламазян Э. К. Гинекология от пубертата до постменопаузы [Текст]: практ.руководство для врачей / Э. К. Айламазян [и др.]; под ред. Э. К. Айламазяна. - 3-е изд., доп. - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 495 с.
6. Ищенко А.И. Эндометриоз: современные аспекты [Текст] / А.И.Ищенко, Е.А.Кудрина. - М.: МИА, 2008. - 173 с.
7. Сидорова И.С. Эндометриоз тела матки и яичников [Текст]: метод. руководство / И.С.Сидорова, Е.А.Коган, А.Л.Унанян. - М.: ММА им. И.М.Сеченова, 2007. - 30 с.
8. Bazzoni F. The tumor necrosis factor ligand and receptor families [Text] / F.Bazzoni, B.Beutler // N. Engl. J. Med. - 1996. - Vol.334, №26. - P.1717-1725.
9. RU Заявка №2008123562, публ. 27.12.2009.
10. RU Заявка №2006143256, публ. 20.06.2008.
11. RU Заявка №2010124978, публ. 27.12.2011.
Способ прогнозирования риска развития доброкачественной дисплазии молочной железы у женщин с генитальным эндометриозом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, определение полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли α 1-го типа (+36 A/G TNFR1), причем при выявлении генотипов+36 АА TNFR1 и +36 AG TNFR1 прогнозируют высокий риск развития доброкачественной дисплазии молочной железы при генитальном эндометриозе.