Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА СУХОГО ОЧИЩЕННОГО ИЗ ТРАВЫ ЗЮЗНИКА ЕВРОПЕЙСКОГО, ОБЛАДАЮЩЕГО ТИРЕОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения тиреотропного препарата - очищенного экстракта сухого травы зюзника европейского.

Зюзник европейский (Lycopus europaeus L.) - многолетнее травянистое слабоопушенное растение из семейства губоцветных, высотой до 80 см. Трава растения содержит орто-дигидроксифенолы: кофейная кислота, этиловый эфир кофейной кислоты, розмариновая кислота, метиловый эфир розмариновой кислоты, лютеолин, протокатеховый альдегид, 5, 3', 4'-тригидрокси-6,7-димитоксифлавон, метиловый эфир лютеолин-7-глюкуронозида, этиловый эфир лютеолин-7-глюкуронозида. Из других фенолов - этиловый эфир апигенин-7-глюкуронозида, из нефенольных соединений - мезоинозит [1-3, 4,5].

Экспериментально установлено, что препараты зюзника угнетают возбудимость сердечной мышцы. Их действие аналогично хинидину - алкалоиду, выделенному из коры хинного дерева. Некоторые исследователи отмечают эффективность зюзника при экстрасистолиях (нарушениях сердечного ритма), приступах сердцебиения, тиреотоксикозе.

В народной медицине препараты растения используют как хорошее успокаивающее, кровоостанавливающее и болеутоляющее средство при неврозах, истерии, бессоннице, головных болях, зобе, сердечной слабости, маточных кровотечениях, болях в области желудка. Немецкие врачи рекомендуют применение спиртового экстракта из травы для лечения эндокардитов и базедовой болезни [6]. Зюзник европейский внесен в Немецкую гомеопатическую фармакопею. В китайской медицине отвар травы с корневищами используется как мочегонное средство при отеках, фурункулах, нарушении менструального цикла, для лечения подагры [7-9].

В экстракте зюзника европейского, согласно литературным и экспериментальным данным [1-3], за биологическую активность препарата ответственны орто-дигидроксифенолы, максимальное содержание которых наблюдается в фазу бутонизации и начала цветения [10]. При этом действуют не сами исходные соединения, а продукты их ферментативного или химического окисления с последующей димеризацией.

Тиреотропные препараты из травы зюзника европейского применяются как в народной медицине, так и в официальной, в частности в гомеопатии. Известны экстемпоральные формы - настои, отвары.

Известен способ приготовления матричной настойки для получения гомеопатических средств [11]. Согласно этому способу свежее измельченное сырье заливается 90% спиртом в количестве 2 md/100, где m - масса сырья, d - потеря в массе при высушивании, и настаивается в течение нескольких дней. Способ получения сухого экстракта в доступной литературе не обнаружен.

Недостатком способа получения экстемпоральных форм является невозможность длительного хранения матричной настойки в гомеопатии - ограничение работы со свежим сырьем во времени, поэтому в качестве прототипа нами выбран способ получения сухого экстракта из травы зюзника европейского, описанный в работе [12].

Согласно этому способу измельченное сырье экстрагируют 40% водным спиртом 1:10 при комнатной температуре. Экстракт упаривают, остаток высушивают, измельчают. Полученная таким способом субстанция содержит всю сумму действующих веществ, но не выдерживает хранения, изменяя консистенцию и превращаясь через несколько месяцев в каменистый конгломерат.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения экстракта сухого очищенного из травы зюзника европейского (суммы орто-дигидроксифенолов), обладающего тиреотропным действием (средства для лечения нарушения функций щитовидной железы), стабильного при хранении, т.е. сохраняющего не только качественный состав и количественное содержание действующих веществ, но и консистенцию (сыпучесть, отсутствие спекания). Последнее особенно важно при приготовлении из субстанции твердых лекарственных форм - капсул и таблеток.

Критерий качества препарата - максимальное содержание действующих веществ и минимальное (или отсутствие) нежелательных балластных веществ.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве сырья используется трава зюзника европейского, заготовленная в фазу бутонизации и начала цветения, а в качестве экстрагента для сырья используется 30%-50% этиловый спирт, позволяющий извлекать как орто-дигидроксифенолы средней полярности, так и обладающие значительной полярностью. Кроме того, водный спирт указанной концентрации хорошо извлекает неорганические соединения (значение этого фактора изложено ниже).

Разбавленный водой кубовый остаток после упаривания водно-спиртового экстракта экстрагируется хлороформом для удаления нежелательных балластных веществ.

Сущность способа заключается в экстракции измельченной травы зюзника европейского 30%-50% этиловым спиртом, упаривании экстракта до полного удаления спирта (до 2-3% исходного объема), разбавлении кубового остатка водой ~ в 4 раза, экстракции хлороформом, отделении водной фазы и упаривании ее до объема первого кубового остатка (при упаривании ее водно-спиртового извлечения), сушки и измельчения.

Технический результат предложения заключается в использовании для экстракции на головной стадии 30%-50% этилового спирта, а для жидкофазной экстракции суммы экстрактивных веществ после упаривания водно-спиртовых извлечений - хлороформ.

Первым отличием заявляемого способа от прототипа является расширение диапазона крепости экстрагента (30-50% этилового спирита вместо 40%). Как известно из литературных данных [1-3], орто-дигидроксифенолы проявляют тиреотропную активность после окисления - ферментативного или химического.

Ферментативное окисление осуществляется катехолоксидазой, катализаторы химического окисления - ионы марганца, меди, цинка. Условия производства сухого экстракта - термическое воздействие в ходе упаривания экстрагента (50±5)°C и сушки (60±2)°C инактивируют катехолоксидазу, в силу чего приобретает исключительное значение химическое окисление. Таким образом, присутствие необходимых неорганических веществ в препарате обеспечивается использованием в качестве экстрагента водного спирта невысокой концентрации (30%-50%). Выбранный нами экстрагент согласуется с результатами работы [13]. Нормализация тиреотоксикоза у животных более эффективна под действием настойки травы зюзника на 40% этаноле по сравнению с действием настойки на 70% и 90% спирте: значение уровня тиреоидных гормонов по сравнению с контрольным 145.5±2.8 составляет 70.4±5; 119.5±12 и 109.1±5.8 соответственно на фоне действия тирозола 55.7±3.8.

Второе отличие от прототипа - включение в технологию получения препарата обработки водной взвеси экстрактивных веществ хлороформом позволяет удалять неполярные смолистые вещества, отрицательно влияющие на качество сухого экстракта. Сухой экстракт, полученный без обработки хлороформом, при хранении через несколько месяцев превращается в каменистый конгломерат. Обработка хлороформом исключает это явление. Содержание действующих веществ, орто-дигидроксифенолов не уменьшается, т.к. они не растворяются в хлороформе.

Известен способ получения сухого экстракта из травы аврана лекарственного, содержащего фенольные соединения [14], где также применяется очистка экстракта от балластных веществ неполярного характера с применением хлороформа. Однако на головной стадии процесса авторы используют 96% спирт, вследствие чего в экстракт переходит значительное количество неполярных примесей - липиды, воски, хлорофилл. Очистка в данном случае с использованием хлороформа (хлористого метилена, дихлорэтана, петролейного эфира) целесообразна, а в иных случаях необходима при условии, что экстрагенты в жидкофазной экстракции не извлекают целевой продукт. При использовании в качестве экстрагента водного этанола невысокой концентрации (30-50%) неполярных балластных веществ в экстракте будет существенно меньше, и такая очистка может быть необязательной. В заявляемом нами способе получения сухого экстракта необходимость применения жидкофазной экстракции с использованием хлороформа диктуется необходимостью сохранения консистенции субстанции.

Пример 1. Растительное сырье - траву зюзника европейского, заготовленного в фазу бутонизации и начала цветения, 0.364 кг, содержащее 0.00314 кг суммы фенольных соединений (влага 8.57%) в пересчете на розмариновую кислоту, измельчают на мельнице, получают 0.350 кг измельченного сырья, содержащего 0.00301 кг суммы фенольных соединений. Измельченное сырье загружают в экстрактор и заливают 3.5 л экстрагента. При первой экстракции первой загрузки используется 40% этиловый спирт, при последующих загрузках на первую экстракцию подается 3-й экстракт предыдущей загрузки с добавлением необходимого количества 40% этилового спирта до объема 3.5 л. Соотношение массы сырья и объема экстрагента 1:10. На вторую и третью экстракции каждой загрузки подается отгон этилового спирта 40% в объеме слитого 1-го и 2-го экстракта соответственно. Время 1-й экстракции 4 часа, 2-й - 3 часа, 3-й - 2 часа. Объединенные 1-й и 2-й экстракты (2.3 л±2.12 л=4.42 л) фильтруют через воронку Бюхнера в колбу Бунзена через вату гигроскопическую, помещенную между двумя листами фильтровальной бумаги, переносят в круглодонную колбу, соединяют с роторным испарителем, снабженным двухрубашечным холодильником. Упаривание ведут при температуре водяной бани (55±5)°C до полного удаления спирта.

Получают 550 мл кубового остатка. К кубовому остатку прибавляют 1650 мл дистиллированной воды и трижды обрабатывают хлороформом: 620 мл, 620 мл, 400 мл.

Хлороформный экстракт удаляют, водную фазу, содержащую целевой продукт, доупаривают до 300 мл, сливают на противень и помещают в электрошкаф сушильный вакуумный. Сушку ведут при температуре (60±2)°C. Сухой экстракт измельчают в ступке с пестиком. Получают 0.0553 кг (влажность 4.45%) готового продукта с содержанием фенольных соединений 5.35% в пересчете на розмариновую кислоту.

Пример 2. Растительное сырье - зюзника европейского трава, соответствующее требованиям ФСП, измельчают до размера частиц не более 5 мм. После измельчения 5.55 кг зюзника европейского травы, содержащей 0.08214 кг фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту, получают 5.50 кг измельченного сырья, содержащего 0.08140 кг фенольных соединений. Измельченное сырье загружают в экстрактор и проводят трехкратную экстракцию 40% спиртом при соотношении массы сырья и объема растворителя 1:10 (55 л), учитывая объем ложного дна экстрактора (50 л). Первую экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 4 часов при постоянном перемешивании. При непрерывном процессе для первой экстракции используют третий экстракт от предыдущей загрузки - 83.9 л и добавляют из сборника 21.1 л спирта этилового 40%. Получают 84.25 л первого водно-спиртового экстракта.

Аналогичным образом проводят еще две экстракции, подавая каждый раз в экстрактор количество экстрагента, равное объему слитого извлечения. Объединенные первый и второй экстракты (165,5 л) фильтруют через нутч-фильтр и упаривают в циркуляционном вакуум-выпарном аппарате при (45±5)°C до 2-3% исходного объема (гарантия полного удаления спирта). Кубовый остаток (4 л) разбавляют 12 литрами воды дистиллированной или очищенной и обрабатывают 4.5 литрами хлороформа, перемешивая водную и органическую фазы барбатированием и/или якорной мешалкой. После расслоения хлороформный экстракт удаляют, водную фазу обрабатывают хлороформом еще 2 раза (4.5 л и 3 л). Очищенный водный экстракт доупаривают в циркуляционном вакуум-выпарном аппарате до 3-4 л и сушат в вакуумной сушилке при (60±5)°C. Получают сухой твердый остаток (1.042 кг), который измельчают с помощью мельницы в аморфный порошок (1.040 кг) с содержанием фенольных компонентов 6.74%.

Пример 3. 50.0 г измельченной травы зюзника европейского трижды экстрагировали 50% при соотношении массы сырья и объема экстрагента 1:10, объемы экстрагента 500 мл, 305 мл и 300 мл. Время 1-й экстракции 4 часа, 2-й - 3 часа, 3-й - 2 часа. Объединенные экстракты 305 мл, 300 мл и 320 мл упаривали до 30 мл (3% исходного объема), разбавляли дистиллированной водой до 120 мл и трижды обрабатывали хлороформом: 30 мл, 30 мл и 20 мл. Хлороформные извлечения отбрасывали, водные упаривали ~ 30-40 мл. Сушили в вакуум-сушильном шкафу при (60±2)°C и измельчали. Получили 11,1 г сухого экстракта с содержанием фенолов 8,03%.

Пример 4. 50.0 г измельченной травы зюзника европейского (той же, что в примере 3) трижды экстрагировали 30% спиртом при соотношении массы сырья и объема экстрагента 1:10, объемы экстрагента 500 мл, 290 мл и 280 мл. Время 1-й экстракции 4 часа, 2-й - 3 часа, 3-й - 2 часа. Объединенные экстракты 290, 280 и 330 мл упаривали до 30 мл, разбавляли дистиллированной водой до 120 мл и обрабатывали хлороформом 3 раза по 30 мл, 30 мл и 20 мл. Хлороформные извлечения отбрасывали, водную фазу с осадком упаривали до ~ 30-40 мл. Сушили в вакуум-сушильном шкафу при (60±2)°C и измельчали. Получили 12,8 г сухого экстракта с содержанием фенолов 6,27%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Н. Winterhoff, H.G. Gumbinger, H. Sourgents. Planta medica, 1988, v. 54 N 2, p. 101.

2. A. Nahrstedt, M. Albrecht, V. Wray, H.G. Gumbinger, M. John, H. Winterhoff, F.H. Kemper. Planta medica, 1990, v. 56, N 4, p. 395.

3. A. Rompel, H. Fischer, D. Meiwes, K. Bült - Karentzopoulos, A. Magrini, C. Eicken, C. Gerdemann, B. Krebs. FEBS LeHers 445 (1999) p. 103-110.

4. H.A. Шелухина, A.A. Савина, В.И. Шейченко, В.И. Осипов, Т.А. Сокольская, В.А. Быков, О.Ф. Ласская. Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии, 2010, №11, с. 7-11.

5. Н.А. Шелухина, А.А. Савина, В.И. Шейченко, В.И. Осипов, Т.А. Сокольская, В.А. Быков, О.Ф. Ласская. Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии, 2011, №3, с. 6-9.

6. Z. Horhammer Zentralhalle 1962, N 12, p. 767.

7. А.И. Шретер, Б.Г. Валентинов, Э.М. Наумова. Природное сырье китайской медицины. Справочник М., Теревинф, 2004, т. 1, с. 506.

8. Н.К. Фруситов. Лекарственные растения Дальнего Востока, Хабаровск, 1972, с. 349.

9. Ф.И. Ибрагимов, B.C. Ибрагимова. Основные лекарственные средства китайской медицины. М.: Медгиз, 1960, с. 441.

10. И.А. Кирьянова, Н.А. Шелухина, А.Н. Зайко, А.А. Савина, В.И. Шейченко, Т.А. Сокольская, В.А. Быков, О.Ф. Ласская. Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии, 2012, №1, с. 144-147.

11. Homoöpathisches Arzneibuch НАВ 2000.

12. Н.А. Шелухина «Изучение метаболома зюзника европейского (Lycopus europaeus L.) и разработка субстанции тиреотропного действия».

13. М.Н. Алефиров. Растительные ресурсы 2009, т. 45, вып. 2, с. 117-122.

14. RU 2482863 С1 Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью.