ОДНОВРЕМЕННОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИЦЕРИНА И АЦЕТАТА КАЛИЯ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ МЕТОДОМ Н ЯМР СПЕКТРОСКОПИИ

Изобретение относится к области физической химии, а именно к применению метода ядерного магнитного резонанса на ядрах ¹Н (¹Н ЯМР спектроскопия) для одновременного количественного определения основных компонентов в водных растворах, содержащих ацетат калия и глицерин. Изобретение может быть использовано при приготовлении и анализе химического состава консервирующих растворов, использующихся при сохранении биологических субстанций в исследовательских учреждениях и музеях биологической направленности.

Актуальным направлением для биомедицинских исследований является проблема консервации и сохранения биологических структур в неизменном состоянии.

При сохранении биологических субстанций в исследовательских учреждениях и музеях биологической направленности при сохранении биологических объектов и структур часто используются концентрированные растворы с различными химическими компонентами, в том числе, с ацетатом калия и глицерином (Патент РФ №2185060). Мониторинг количественного содержания компонентов данных растворов, позволяет не только контролировать необходимые концентрации реагентов в растворах, но и осуществлять опосредованную оценку состояния сохраняемых биосубстанций.

В настоящее время количественное содержание ацетата калия и глицерина в консервирующих растворах осуществляется с помощью аналитических методик на основе метода потенциометрического титрования. Аналитические методики определения концентрации данных веществ в высококонцентрированных водных растворах показывают довольно хорошую точность определения, однако отличаются трудоемкостью, требуют больших временных и материальных затрат и относительно большого количества анализируемой пробы.

Известен метод количественного определения содержания в консервирующих растворах глицерина и ацетата калия методом спектроскопии комбинационного рассеяния (рамановской спектроскопии). Данный метод может служить средством неразрушающего количественного экспресс-анализа химического состава водных растворов для консервации и сохранения биологических структур, в том числе с использованием портативных приборов [1]. Несмотря на свои преимущества (быстрый анализ, возможность снятия спектров растворов через пластмассовую или стеклянную тару) метод рамановской спектроскопии не обладает достаточной точностью количественного определения компонентов растворов.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка количественного определения содержания глицерина, ацетата калия и воды в консервирующих растворах методом ¹Н ЯМР.

Техническим результатом является высокая точность количественного определения, уменьшение количества анализируемых проб (работа с микрограммовыми навесками), уменьшение времени на проведение анализа, снижение трудоемкости и материальных затрат относительно других известных методов.

Технический результат достигается за счет использования способа одновременного количественного определения ацетата калия и глицерина в водном растворе методом ¹Н ЯМР, включающим 12-ти кратное разбавление исследуемого раствора, получение спектра при следующих параметрах: время отклика - 5 сек; длина радиочастотного импульса - 3,3 μсек (10 град.); релаксационная задержка - 10 сек; количество накоплений - 16. Затем в спектре ¹Н ЯМР определяют интегральную интенсивность сигналов, после чего по полученным значениям интегралов в диапазонах химических сдвигов 1,8-2,0; 3,4-3,8 и 4,6-4,9 м.д. рассчитывают молярное и масс-процентное содержание каждого компонента.

Принципиально новые возможности метода ¹H ЯМР позволяют применить его в новых областях, в том числе, в исследовании консервирующих растворов. Метод основан на регистрации спектров резонансных частот протонов химических молекул с последующим вычислением интегральных площадей пиков, которые строго пропорциональны количеству резонирующих атомов. Положение сигналов в спектрах ЯМР индивидуально для каждого вещества и характеризуется химическим сдвигом относительно сигнала эталонного образца.

Предлагаемое техническое решение поясняется следующей методикой проведения анализа.

Предлагается способ одновременного количественного определения глицерина и ацетата калия в водном растворе методом ¹Н ЯМР-спектроскопии, в котором положение сигналов в спектрах для каждого химического вещества характеризуется химическим сдвигом, измеряемым в миллионных долях (м.д.). Сущность методики заключается в определении интегральной интенсивности сигналов компонентов консервирующего раствора, в котором отношение приведенных интегралов сигналов различных молекул равно отношению количества молекул (молей) веществ в анализируемом образце. На первом этапе анализа регистрируется ¹Н ЯМР спектр. Далее производится интегрирование сигналов. Сигналы компонентов хорошо разделены, обеспечивая высокую точность определения значения интегралов.

Определение содержания воды, глицерина и ацетата калия в экспериментальных водных растворах проводили методом ¹Н ЯМР. Результатом анализа методом ¹H ЯМР являлось определение молярного и масс-процентного состава компонентов в консервирующем растворе. Спектры получали на спектрометре GEMINI 200 (Varian,CIIIA).

При проведении анализа предварительно определяли положение сигналов в спектрах ЯМР для каждого определяемого вещества, характеризующееся их химическим сдвигом. Для этого методом ¹Н ЯМР-спектроскопии проводили анализ каждого компонента отдельно и в смеси. Образец ¹Н ЯМР спектра консервирующего раствора с характерными для ацетата калия, глицерина и воды областями химического сдвига пиков представлен на рисунке 1.

Полученные данные показали, что сигналы компонентов раствора хорошо разделены и не пересекаются между собой, что позволяет определять эти компоненты в одном растворе. Относительная ошибка методики обусловлена только ошибкой измерения интегралов. При выбранных параметрах получения и математической обработки спектра коэффициент сигнал-шум превосходит значение 100 и ошибка измерения интегралов не превосходит 1%. Данный показатель свидетельствует о высокой точности этого метода.

Далее определяли точность метода ¹Н ЯМР-спектроскопии для количественного определения ацетата калия и глицерина в водном растворе. Для этого проводили анализ одной серии из трех водных растворов ацетата калия с известной концентрацией (25,0; 30,0 и 35,0% масс) и другой серии из трех растворов глицерина с известной концентрацией (25,0; 30,0 и 35,0% масс). Затем вычисляли значения для построения калибровочных кривых для каждого вещества. Для сопоставительного анализа аналитические исследования растворов проводили по методикам на основе потенциометрического титрования. Для выполнения методик определения ацетата калия и глицерина применяли многофункциональный автоматический титратор DL70 (фирма MettlerToledo, Швейцария), укомплектованный автоматическими бюретками и управляемый с помощью программного обеспечения Lab X. В работе использовался рН/мВ/°С-метр HI1230B HANNA (Германия). (Рис. 2-4).

Проводили сравнение результатов анализа опытных водных растворов с разным содержанием ацетата калия и глицерина двумя методами - методом титрования, применяющимся в настоящее время, и исследуемым методом ¹Н ЯМР-спектроскопии (см. таблицу). Спектроскопический метод использовали следующим образом: получали спектры проб с различным содержанием ацетата калия, глицерина и воды методом ¹Н ЯМР-спектроскопии и вычисляли масс-процентное содержание каждого вещества посредством расчета значений интегралов. Исследования выполнены на пробах экспериментальных водных растворов как с одновременным содержанием глицерина и ацетата калия в диапазоне концентраций 24-36%, так и по отдельности в том же диапазоне концентраций.

Исследованные пробы растворов в диапазоне концентраций определяемых веществ 24-36% указаны в таблице: 1). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 29,50% масс и глицерин - 30,00% масс); 2). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 34,50% масс и глицерина - 35,50% масс); 3). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 24,50% масс и глицерина - 25,50% масс; 4). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 34,50% масс и глицерин - 25,50% масс); 5). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 25,00% масс и глицерина - 35,00% масс); 6). проба водного раствора глицерина и ацетата (ацетат калия - 30,50% масс и глицерина - 32,00% масс. Ацетат калия предварительно просушивали при t=105°C до достижения постоянного веса и охлаждали в закрытом бюксе. Реактивы дозировали по массе с помощью весов Kern ABJ 120-4М (Германия) с точностью до 0,0001 г.

В исследованиях использовали следующие реактивы: глицерин (ч.д.а., соответствует ГОСТ 6259-75, Германия); калий уксуснокислый (extrapure, «Merk», Германия); свежеприготовленная деионизованная вода (ГОСТ 6709-72); вода дейтерированная; химические реактивы фирмы «ДиАМ», Россия: соляная кислота 0,1н раствор (фиксанал); калий хлористый, х.ч.; перйодат калия, ч.д.а.; этиленгликоль, ч.д.а.; калий гидроксид, 0,05н. раствор (фиксанал).

Результаты анализа растворов с разным содержанием основных компонентов двумя методами, методом титрования, применяющимся в настоящее время, и методом ¹Н ЯМР-спектроскопии, приведены в таблице. Результаты измерения компонентов раствора методом ¹Н ЯМР-спектроскопии соответствуют их истинному количественному содержанию, а также сопоставимы с результатами, полученными методом титрования.

Пример 1. В микрокювету объемом 2 мл переносят 0,05 мл исследуемого раствора. Добавляют 0,6 мл воды дейтерированной. Раствор перемешивают и переливают в ампулу для съемки спектров ЯМР. Спектр получают при следующих параметрах, позволяющих к следующему импульсу системе ядер прийти в термическое равновесие: время отклика - 5 сек; длина радиочастотного импульса - 3,3 μсек (10 град.); релаксационная задержка - 10 сек; количество накоплений - 16.

Интегрирование сигналов производят в следующих областях:

1. 1,8-2,0 м.д. - сигнал протонов метальной группы ацетата калия;

2. 3,4 - 3,8 м.д. - сигналы протонов метиленовых и метановой групп глицерина;

3. 4,6 - 4,9 м.д. - сигнал протонов воды.

Масс процентное содержание компонентов в смеси определяют по формуле, приведенной в ОФС.1.2.1.1.0007.15 [2]:

I'₁=I₁/3; I'₂=I₂/5; I'₃=(I₃-0,6×I₂)/2,

где I₁, I₂,1₃ и I'₁, I'₂, I'₃ - значения измеренных и приведенных интегралов сигнала протонов метальной группы ацетата калия, сигнала протонов метиленовых и метановой групп глицерина и сигнала протонов воды соответственно.

В формулах расчета значений интегралов из измеренных значений учтено, что в сигнал измеряемого интеграла метильной группы ацетата калия вносят вклад три протона, в сигнал измеряемого интеграла сигнала глицерина вносят вклад пять протонов, в сигнал протонов в области 4,60 - 4,90 м.д. вносят вклад протоны гидроксильных групп глицерина. В сигнал воды вносят вклад два протона.

Определение масс процентов ацетата калия (1), глицерина (2) и воды (3) проводят по следующим формулам:

где M₁=98,142; M₂=92,094; M₃=18,015 - молярные веса ацетата калия, глицерина и воды соответственно.

При выбранных параметрах получения и математической обработки спектра коэффициент сигнал-шум превосходит значение 100 и ошибка измерения интегралов не превосходит 1%.

В отличие от метода потенциометрического титрования метод ¹Н ЯМР является недеструктивным методом, обладает значительно меньшей трудоемкостью, не требует наличия большого количества лабораторной посуды и реагентов, суммарное время пробоподготовки и измерения не превышает 15 мин., что намного меньше времени измерения содержания компонентов раствора другими методами. Вес пробы для анализа значительно меньше (около 50 мг), в то время как для метода титрования требуется не менее 25 г. Кроме того, метод позволяет анализировать одновременно несколько основных компонентов раствора в одной пробе.

Таким образом, метод ¹Н ЯМР имеет ряд преимуществ по сравнению с применяющимся в настоящее время методом титрования, и может применяться для определения количественного содержания ацетата калия, глицерина и воды в консервирующих высококонцентрированных водных растворах, использующихся при сохранении биологических субстанций.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аграфенин А.В., Абрамов Ю.В., Денисов-Никольский Ю.И., Блинова Г.И. Одновременное количественное определение глицерина и ацетата калия в водном растворе методом спектроскопии комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия). Микроэлементы в медицине. 2014. Т. 15. Вып. 3. С. 48-51.

2. ГФ XIII, ОФС.1.2.1.1.0007.15 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса.