Результат интеллектуальной деятельности: ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО ПРИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЯХ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к использованию лекарственного средства растительного происхождения в качестве иммуномодулирующего средства. Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является средство, обладающее широким фармакологическим действием, в частности высокой противовирусной активностью в отношении ДНК-геномных вирусов, и запатентованное в ряде зарубежных стран, представляющее собой природное индивидуальное соединение ксантоновой природы состава C₁₉C₁₈O₁₁ (мангиферин), получаемое из двух видов сырья копеечника (Hedyzarum alpium L., H.flavescens Rql. et Smalh. семейства бобовые - Fabaceae) и листьев манго (Mangifera indica L.) семейства Сумаховые (Anacardiaceae) [Вичканова С.А., Л.Д.Шипулина, В.И.Глызин, Авторское свидетельство СССР №1336301. Патенты: Англия №2108383; США №4436732, кл. А.61.К 37/02, 1989; Франция №81198820; ФРГ №31411970; RU 2308961 С₂, 27.10.2007].

Недостатками являются:

1. Проявление у алпизарина эмбриотоксического эффекта, вследствие чего невозможность его использования в период беременности и лактации для лечения герпесвирусных заболеваний.

2. Алпизарин в качестве иммуномодулирующего средства в медицинской практике не применяется.

Задачей данного изобретения является расширение ассортимента иммуномодулирующих средств растительного происхождения, а также создание лекарственного средства, не обладающего имеющимися у прототипа недостатками и проявляющего эффективное иммуномодулирующее действие при вторичных иммунодефицитных состояниях.

В результате исследований по поиску и созданию эффективных лекарственных противоинфекционных (противовирусных и антимикробных) средств растительного происхождения выявили активность флавоноидных соединений, проявляющих противогерпетическую активность в отношении вируса простого герпеса I типа (ВПГ-1) и являющихся потенциальными объектами для разработки противогерпетических препаратов [3]. На основе данного класса соединений проводили поиск и разработку лекарственных препаратов противовирусного действия, в результате которой ранее был создан «Алпизарин», а позднее - лекарственное противовирусное средство флавоноидной природы, далее по тексту Фитосубстанция, представляющая собой сухой очищенный стандартизованный экстракт (содержание не менее 55% суммы флавоноидов), получаемый из надземной части (травы) двух растений семейства бобовые (Fabaceae): дикорастущей леспедецы копеечниковой (Lespedeza hedysaroides Rail. Kitag) и травы культивируемого растения десмодиум канадский (Desmodium canadense D.С.).

Фитосубстанцию из обоих видов растений получали по следующей схеме: надземную часть экстрагировали водно-спиртовой смесью, очищали от балластных веществ липофильного характера. Сумму флавоноидов из очищенного водного экстракта извлекали н-бутиловым спиртом, насыщенным водой. Извлечение частично упаривали, очищали и сушили при 170-75°С в вакуум-сушильном шкафу [4].

Биологическая активность фитосубстанции, выделенной из травы леспедецы копеечниковой («Хелепин»), или из травы десмодиума канадского («Хелепин Д»), обусловлена наличием суммы флавоноидов, близкой по составу, основными компонентами которой являются изовитексин, витексин, изоориентин. Предварительные исследования показали, что фармакологическая активность отдельных компонентов не превышала таковой по сравнению с суммой природных флавоноидов. Фитосубстанция представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета со специфическим запахом.

В экспериментальных и клинических исследованиях разных лет, связанных с фитосубстанцией, полученной из обоих растений, для объективной сравнительной оценки результатов использовали наименования (под которыми произошло их разрешение для применения в медицинской практике): Фитосубстанция из леспедецы копеечниковой - «Хелепин», а к аналогичной Фитосубстанции из десмодиума канадского добавлена буква Д - «Хелепин Д» [5, 6].

Исследования показали наличие одинаковой фармакологической активности, отсутствие токсических свойств и высокую равнозначную клиническую эффективность при одинаковых инфекционно-воспалительных нозологических формах, на основании которых Хелепин и Хелепин Д разрешены к применению в медицинской практике в качестве противовирусного средства [5-7].

Изобретение расширяет арсенал лекарственных средств, применяемых для лечения заболеваний, протекающих на фоне вторичных иммунодефицитных состояний.

Поставленная задача решается применением Хелепина или Хелепина Д в качестве иммуномодулирующего средства при вторичных иммунодефицитных состояниях.

Было проведено экспериментальное изучение Хелепина или Хелепина Д в отношении вируса простого герпеса (в опытах in vitro и in vivo) и патогенных бактерий (в опытах in vitro).

Сравнительное экспериментальное изучение в опытах in vitro показало наличие у обоих препаратов одинакового вирусингибирующего эффекта, проявляющегося в отношении вируса простого герпеса в концентрации 10 мкг/мл. В опытах in vivo на модели герпетического энцефалита белых мышей Хелепин и Хелепин Д при введении подкожно или внутрижелудочно оказывали равнозначный положительный химиотерапевтический эффект, приводя к 30-80% или 20-70%, соответственно, выживаемости мышей, при 100% гибели в контроле. Изучение противомикробной активности показало, что Хелепин и Хелепин Д ингибировали (в концентрации 200-500

мкг/мл) рост и развитие микроорганизмов рода Staphylococcus, Proteus, Pseudomonas.

Изучение острой (при однократном введении) или хронической (при введении в течение 3 месяцев) токсичности Фитосубстанции, выделенной из леспедецы копеечниковой (Хелепин) или десмодиума канадского (Хелепин Д), показало одинаковую безопасность и отсутствие какого-либо токсического влияния на основные органы и системы организма лабораторных животных: кровь, гематологические и биохимические показатели, функциональное состояние печени и почек, ЦНС и сердечно-сосудистую и иммунную системы.

Экспериментальные токсикологические исследования лекарственных форм не выявили противопоказаний для клинических исследований Хелепина или Хелепина Д как при приеме внутрь (таблетки 0,1 г), так и при наружном применении (5% и 1% мазь).

Клиническое применение Хелепина или Хелепина Д в качестве общерезорбтивного (таблетки) и местного (мазь) противовирусного средства при инфекционно-воспалительных заболеваниях вирусной, поствирусной или предположительно вирусной этиологии у 936 пациентов взрослого и детского (старше 7 лет) возраста и 149 детей в возрасте от 1 года до 14 лет показало хорошую переносимость (ни в одном случае не было побочных явлений) и высокий (от 80% до 100%) лечебный эффект.

Изучение специфических видов токсичности не выявило у Хелепина или Хелепина Д аллергизирующих, местнораздражающих, мутагенных, тератогенных и эмбриотоксических свойств. У прототипа - Алпизарина - установили наличие эмбриотоксического действия, что послужило основанием считать беременность противопоказанием при его использовании в медицинской практике.

Дальнейшее исследование позволило выявить у Хелепина и Хелепина Д дополнительные фармакологические свойства, а именно - противовоспалительные, гепатозащитные, диуретические и гипоазотемические, известные к настоящему времени.

При проведении экспериментов по изучению специфических видов токсичности неожиданно выявили наличие иммуномодулирующих свойств (пример 1).

Пример 1. Изучение иммуномодулирующих свойств Фитосубстанции, выделенной из леспедецы копеечниковой (Хелепин) или десмодиума канадского (Хелепин Д) и Алпизарина.

Методика. Оценку влияния Фитосубстанции и Алпизарина на гуморальное звено иммунитета проводили на крысах Вистар (самцы, 180-200 г). Препараты вводили в желудок в дозах 1, 10 и 100 мг/кг в течение 4-х недель, после чего животных иммунизировали оптимальной дозой эритроцитов барана (ЭБ) (5×10⁸) и иммунный ответ на гетерогенные эритроциты оценивали на 5-ые сутки после антигенной нагрузки. Результаты эксперимента определяли по титру антител к ЭБ в микротесте гемагглютинации и количеству антителобразующих клеток (АОК) в селезенке. Число АОК определяли методом локального гемолиза в модификации Cunningham. Влияние Фитосубстанции и Алпизарина на клеточный иммунитет проводили в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах линии CBA/Lac (самцы, 20-22 г), которых иммунизировали подкожным введением в межлопаточную область эритроцитами барана в дозе (2×10⁸ клеток на мышь).

Фитосубстанция и Алпизарин вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозах 1, 10 и 100 мг/кг за сутки до иммунизации ЭБ («Д-1»), одновременно с иммунизацией («Д-0») и через 24 часа после инъекции антигена («Д+1»). Контрольные мыши получали внутрибрюшинно в «Д+1» соответствующие количества - 0,85% раствор NaCl. На 5-е сутки после иммунизации все животные получали субплантарно в левую заднюю лапу разрешающую инъекцию ЭБ в дозе 5×10⁸ клеток на мышь в объеме 50 мкл (опытная лапка). В подушечку контрлатеральной лапы (контрольная лапка) вводили 50 мкл 0,85% раствора NaCl. Результаты реакции регистрировали через 24 часа путем взвешивания «контрольной» и «опытной» лапок: разница в их массе характеризовала величину отека и интенсивность реакции ГЗТ. Индекс реакции вычисляли по формуле: U=[(m₀-m_k)/m_k]×100%, где m₀ - масса опытной лапки; m_k - масса контрольной лапки. Кроме того, проводили определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови (опсоно-фагоцитарный индекс - ОФИ) у крыс Вистар, получавших Фитосубстанцию и Алпизарин в дозах 1, 10 и 100 мг/кг в течение 4-х недель.

Результаты. Эксперименты показали (таблица 1), что длительное введение Фитосубстации (Хелепин или Хелепин Д) в желудок крысам практически одинаково приводило к активизации гуморального иммунитета, причем наиболее выраженный эффект наблюдали при введении в дозе 1 мг/кг.

Введение Фитосубстанции в дозе 1 мг/кг повышало количество АОК в селезенке примерно в 4 раза. Увеличение дозы Фитосубстанции в 10 и 100 раз не приводило к повышению количества АОК. При этом титр гемагглютининов в сыворотке наиболее высоким наблюдали при введении Фитосубстанции в дозе 1 мг/кг. Введение Алпизарина в тех же условиях опыта в дозах 1, 10 и 100 мг/кг приводило к дозозависимому иммуностимулирующему эффекту. Изучение влияния Фитосубстанции и Алпизарина на клеточное звено не выявило действия на эффекторы клеточного иммунитета в реакции ГЗТ, но показало увеличение в 2-3 раза фагоцитарной активности лейкоцитов, что свидетельствовало об усилении общей резистентности организма экспериментальных животных под действием Фитосубстанции и Алпизарина. Фитосубстанция и Алпизарин, примерно в одинаковой степени, повышали неспецифический иммунитет, увеличивая опсоно-фагоцитарный индекс (чертеж).

Исследования показали, что Фитосубстанция, выделенная из леспедецы копеечниковой (Хелепин) или десмодиума канадского (Хелепин Д), и Алпизарин в экспериментах на животных во всех испытанных дозах стимулировали образование антител к тимус-зависимому антигену, повышая активность эффекторов гуморального иммунитета. Однако максимум иммуностимулирующего эффекта Алпизарина проявлялся только в высокой дозе 100 мг/кг, у Фитосубстанции иммуностимулирующий эффект проявлялся и в более низких (близким к терапевтическим) дозах (1-10 мг/кг). Эксперименты показали, что Фитосубстанция и Алпизарин примерно в одинаковой степени повышали неспецифический иммунитет, увеличивая опсоно-фагоцитарный индекс (чертеж).

Таким образом, данное экспериментальное исследование Фитосубстанции, выделенной из обоих видов растительного сырья, позволило выявить новое фармакологическое свойство - иммуномодулирующее, которое может способствовать не только повышению качества противоинфекционного лечения, но и расширению спектра применения в медицинской практике, в том числе при инфекционно-воспалительных заболеваниях на фоне вторичных иммунодефицитных состояний.

В клинических условиях при лечении вирусных осложнений у пациентов с тяжелыми заболеваниями другой этиологии (онкологические заболевания кроветворной и лимфатической системы, гнойно-воспалительные поражения ЦНС), вызывающих вторичное иммунодефицитное состояние, выявили иммуномодулирующие свойства заявленной Фитосубстанции.

Данные исследования проводили в 2 специализированных лечебных учреждениях: НИИ детских инфекций (Клиника нейроинфекций) города Санкт-Петербург; ДО НИИ ВОНЦ РАМН (Отделение детской гематологии).

141 пациенту в возрасте от 2 до 14 лет с острым и рецидивирующим герпесом экстрагенитальной и генитальной локализации, опоясывающим лишаем и герпетиформной экземой Капоши, ОРВИ, псориазом и др. применяли Фитосубстанцию внутрь (таблетки 0,1 г) и/или местно (1% мазь). Особенность клинических исследований Фитосубстанции состояла в том, что у детей, находящихся на лечении в Клинике нейроинфекций НИИ ДИ (г.Санкт-Петербург) и Отделении детской гематологии НИИ ДО ВОНЦ РАМН, применение Фитосубстанции при вирусной инфекции (герпетическая инфекция, ОРВИ, контакты с ветряной оспой) протекало на фоне лечения тяжелых основных заболеваний другой этиологии (гнойно-воспалительные заболевания ЦНС, онкологические заболевания крови и лимфы). Детям с онкопатологией и нейропатологией Фитосубстанцию применяли на фоне специализированного лечения основного заболевания. При абортивной форме герпеса использовали только наружное применение 1% мази Хелепина Д, которую наносили на очаги поражения на коже или слизистых оболочках 4-6 раз в сутки. При генерализованных формах и явлениях общей интоксикации (высокая температура, боли, озноб и др.) одновременно давали таблетки 0,1 г внутрь в возрастных дозировках. Больные герпетиформной экземой Капоши дополнительно получали специальную терапию.

Клинические исследования показали, что назначение Фитосубстанции при различных формах вирусных поражений у детей, даже ослабленных другим тяжелым заболеванием (менингит, гемобластозы и др.), более эффективно, чем традиционная терапия. При последующем наблюдении в течение 6 месяцев у этих детей рецидивов не наблюдали. У детей с различными формами злокачественных новообразований кроветворной и лимфатической тканей (вторичное иммунодефицитное состояние) применение Фитосубстанции для лечения вирусной инфекции (Herpes simplex, Herpes zoster, ОРВИ, контакт по ветряной оспе) показало его высокую эффективность при полном отсутствии побочных эффектов. Особый интерес представляли данные об эффективности Фитосубстанции при острых респираторных инфекциях, в этиологии которых, как известно, могут иметь место различные вирусы, в том числе рино- и аденовирусы (примеры №№2, 3).

Пример 2. Клинические исследования Хелепина Д при вирусных осложнениях, проведенные в Клинике нейроинфекций НИИ детских инфекций (г.Санкт-Петербург).

Объем исследования. Исследование проводили для выявления терапевтической эффективности препарата у 16 детей с острой и рецидивирующей герпетической инфекцией кожи лица и рук и слизистой оболочки полости рта и носоглотки, находящихся на стационарном лечении по поводу гнойных менингитов (10 детей) и других инфекционно-воспалительных заболеваний центральной нервной системы: невриты черепно-мозговых нервов, клещевой энцефалит и др. (6 детей). На фоне указанных заболеваний у 9 детей диагносцировали герпес губ, у 5 детей - герпес лица, у 1 ребенка - герпетический стоматит, у 1 - герпес правой ладони. У 12 пациентов - высыпания выражались в умеренной степени и без наличия отеков, невралгии, увеличения или болезненности лимфоузлов. У 4 детей появление герпетических поражений сопровождалось лихорадкой и общим недомоганием в течение 2 суток. Одновременно под наблюдением (амбулаторно) находились 10 взрослых пациентов (родители детей, сотрудники отделения), контактирующих с больными детьми и страдающих острой или рецидивирующей герпетической инфекцией. У всех 10 взрослых пациентов инфекция проявлялась герпетическим поражением кожи лица, губ, стоматитом, у 7 пациентов наблюдали сочетание нескольких симптомов на фоне выраженного общего недомогания: лихорадки (до 37,5°) и вегетативных нарушений (слезотечение, потливость, инъекция сосудов склер) в течение 3-5 суток.

Методика. Хелепин Д назначали детям в виде таблеток 0,1 г (внутрь) и 1% мази (на очаги поражения). Дозы соответствовали Хелепину, ранее разрешенному в качестве противовирусного средства. Курс лечения у детей составлял от 4 до 15 суток, у взрослых - 10-20 суток. Из 16 детей 11 получали как таблетки, так и местное лечение, 5 детей - только мазь. Все 10 взрослых пациентов получали одновременно таблетки и 5% мазь.

Результаты. Клинический эффект наступал в среднем на 3-4 сутки лечения: уменьшался отек, исчезали вегетативные нарушения, лихорадка, наступало субъективное улучшение состояния больного. Через 4-5 суток у пациентов наблюдали подсыхание герпетических элементов, через 7-10 - суток отпадение корочек. Динамика лабораторных показателей клинического анализа крови показала снижение количества лейкоцитов и СОЭ в 2 раза, а также увеличение в 4 раза количества лимфоцитов, что свидетельствует об иммунокорригирующем действии Хелепина Д. Кроме того, отмечено значительное улучшение показателей клинического анализа мочи (таблица 2). Результаты лечения Хелепином Д свидетельствуют о полной безопасности лечения данным препаратом, не приводящим к патологическим изменениям организма больного, аллергическим или другим реакциям.

Эффективность по данным Клиники нейроинфекций НИИ детских инфекций у всех больных детей и взрослых составила 100% (таблица 3). Хелепин Д является эффективным и не дающим побочных осложнений средством лечения герпетических поражений кожи лица и рук, а также слизистой оболочки полости рта и носоглотки у детей и взрослых на фоне вторичного иммунодефицитного состояния.

Наряду с высокой противовирусной активностью, сохраняющейся на фоне вторичного иммунодефицита, заявленная Фитосубстанция оказывает иммунокоррегирующее действие на организм больных с вторичным иммунодефицитным состоянием.

Пример 3. Применение в качестве противовирусного средства Хелепина Д на фоне онкологических заболеваний (по данным Отделения детской гематологии ДО НИИ ВОНЦ РАМН).

Объем исследования. Хелепин Д в виде таблеток по 0,1 г и 1% мази применяли у детей, больных гемобластозами, осложненными вирусными инфекциями. Лечение Хелепином Д проводили у 54 детей (в возрасте от 4 до 14 лет) с основным диагнозом: у 32 детей - лимфогранулематоз, у 21 - лимфосаркома, у 1 - тератома средостения, 28 детей имели генерализованные стадии заболевания - III-IV. У 12 детей диагностировали рецидив основного заболевания. Дети находились на различных этапах специального программного лечения (химиотерапия, лучевая терапия). Кроме детей лечение Хелепином Д получали 7 взрослых пациентов (сотрудников Отделения) с вирусной инфекцией.

Показаниями для назначения в качестве противовирусного средства Хелепина Д являлись: присоединение герпетической инфекции, острой респираторной вирусной инфекции и контакт с ветряной оспой. Herpes simplex наблюдали у 16 детей с различной локализацией герпетических высыпаний: в области губ - 15 детей, в области носа - 1. У всех детей отмечали лихорадку (до 38,5°) в течение 1-2 суток. Хелепин Д назначали на 1-3 сутки (от появления герпетических высыпаний) в виде таблеток по 0,1 г 3 раза в день и 1% мази одновременно в течение 3-5 суток.

Результаты. У 11 детей с Herpes simplex отметили (табл.4) образование корочки на 2 сутки и очищение кожи на 3-4 сутки. У 3 детей, несмотря на полный эффект в области первичного очага, на 5-6 сутки применения препарата отметили появление новых участков герпетического поражения и лечение продолжили. У 2 детей эффект при применении препарата отсутствовал.

Herpes zoster наблюдали у 7 детей с различной локализацией высыпаний: в области груди и спины (3), на протяжении всей правой конечности (1), в области волосистой части головы (1), ушной раковины (1), в области передней брюшной стенки (1). Выспания сопровождались болезненностью, зудом, лихорадкой (до 38-39°). Хелепин Д назначали в виде таблеток (по 0,1 г 3-4 раза в сутки) и 1% мази (на 2-4 сутки от начала инфекции в течение 5-10 дней). У 3 детей наступило купирование лихорадки, болезненности и зуда, а также прекращение свежих высыпаний на 2 сутки приема препарата, у 4 детей - купирование распространения процесса и полное излечение к 10 суткам.

При профилактике ветряной оспы Хелепин Д назначали 2 детям по 0,1 г 3 раза в сутки в течение 5 дней в связи с непосредственным контактом с ветряной оспой. Развития ветряной оспы не наступило.

При острых респираторных вирусных инфекциях таблетки Хелепина Д назначали 38 детям с различными формами гемобластозов при присоединении симптомов ОРВИ в суточной дозе 0,1 г 3-4 раза в день в течение 5-7 суток. У 31 ребенка выявили улучшение состояния на 3-4 сутки применения препарата и полное купирование на 4-5 сутки, у 3 детей - инфекционный процесс купировали на 7-9 сутки, у 5 детей применение Хелепина Д не оказало эффекта. Побочные явления при применении Хелепина Д не отметили ни в одном случае.

На основании проведенного клинического исследования Хелепина Д в Отделении детской гематологии ДО НИИ ВОНЦ РАМН у детей с различными формами злокачественных новообразований кроветворной и лимфатической тканей, имевших сопутствующие вирусные инфекции (Herpes simplex et zoster, ОРВИ, контакт по ветряной оспе), установлена высокая эффективность Хелепина Д при полном отсутствии побочных эффектов. Известно, что вторичное иммунодефицитное состояние, сопровождающее развитие опухоли и усугубляющееся применением интенсивных программ химиолучевой терапии, способствует частому развитию у данной категории больных вирусных инфекций, которые обычно принимают тяжелое и затяжное течение и затрудняют проведение специальной основной терапии. В связи с этим, Хелепин Д, обладающий противовирусными и иммунокоррегирующими свойствами, оказывал существенную помощь в лечении детей с тяжелой опухолевой патологией, приводящей к развитию вторичного иммунодефицита.

Положительный эффект заключается в установлении иммуномодулирующих свойств заявленной Фитосубстанции (Хелепин Д или Хелепин), при вторичных иммунодефицитных состояниях:

- в клинических условиях в проявлении иммунокоррегирующих свойств на организм пациентов с вторичным иммунодефицитным состоянием и сохранении высокого лечебного противовирусного эффекта при инфекционно-воспалительных заболеваниях, протекающих на фоне вторичного иммунодефицита;

- в экспериментальных условиях установление иммуномодулирующих свойств на эффекторы гуморального иммунитета, повышение общей резистентности организма лабораторных животных и выявление безопасности в острых и хронических экспериментах.

Источники информации

1. Вичканова С.А., Л.Д.Шипулина, В.И.Глызин. «Противовирусное средство алпизарин». Авторское свидетельство СССР №1336301. Патенты: Англия №2108383; США №4436732, кл. А.61.К 37/02,1989; Франция №81198820; ФРГ №31411970.

2. RU 2308961 С₂, 27.10.2007.

3. Вичканова С.А., Шипулина Л.Д., Баньковский А.И., Глызин В.И., Шелюто В.Л. Флавоноидные соединения, проявляющие противогерпетическую активность. Авторское свидетельство №491387 с приоритетом от 18.07.1974 г. Гос. Реестр изобр. СССР 22.07.1975 г.

4. Глызин В.И., Янулис В.П., Вичканова С.А., Шипулина Л.Д., Перельсон М.Е. Способ получения противовирусного препарата «Хелепин». Авторское свидетельство №648032 с приоритетом от 20.09.1977 г. Гос. Реестр изобр. СССР 20.10.1978 г.

5. Государственный реестр лекарственных средств. - Том 1. - М. - 2006. - С.88, 514 (хелепин).

6. Государственный реестр лекарственных средств. - Том 1. - М. - 2006. - С.88, 514 (хелепин Д).

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Часть II. - М. - 1993. - С.402.