СПОСОБ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ РЕСПИРАТОРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТЕЛЯТ

Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается способа неспецифической иммунопрофилактики респираторных болезней телят и может быть использовано для повышения защитных иммунологических механизмов организма при смешанных респираторных болезнях телят вирусно-бактериальной этиологии.

Респираторные болезни являются комплексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса, физиологических и экологических факторов. Спектр микроорганизмов, участвующих в данной патологии, может достигать до 12 вирусов и более 13 бактерий. Обычно клинические признаки проявляются в возрасте 35-45 дней, что объясняется расходованием и естественным разрушением в данный период колостральных факторов защиты при недостаточном их образовании в собственном организме. Массовые респираторные болезни телят проявляются как смешанные вирусные и вирусно-бактериальные инфекции, отличающиеся особенно злокачественным течением. Диссеменация вирусов во внешней среде приводит к постоянному вовлечению в эпизоотический процесс новых животных. Скрытое вирусоносительство у переболевших животных способствует формированию стационарно неблагополучных очагов. Латентно происходящие вирусные инфекции инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых приводят к формированию вторичных иммунодефицитов. Возбудители постоянно реактивируются из латентного состояния и выделяются во внешнюю среду. В большинстве случаев реактивация происходит под воздействием стрессов, и этот процесс не контролируется. Присутствие возбудителей не только в пораженных респираторных органах, но и во внешней среде затрудняет борьбу с респираторными заболеваниями и способствует формированию стационарно неблагополучных очагов. На практике подтверждена эффективность способов профилактики и лечения массовых респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных с применением аэрозолей лекарственных препаратов, которые одновременно санируют как воздух помещений, так и дыхательные пути респираторных органов. Кроме того, аэрозоли профилактических и лечебных средств всасываются в двадцать раз эффективнее, а расход препаратов уменьшается в четыре раза. При этом обеспечивается максимальное проникновение биопрепаратов в очаги поражения, длительное время сохраняется их высокая концентрация в крови и легких [1].

Разнообразие причин возникновения респираторных заболеваний снижает эффективность применения специфических препаратов. Так, применение вакцин в возрасте 15-20 дней неэффективно, т.к. иммунная система у молодняка способна реагировать на антигены с 1,5-2 месячного возраста. Кроме того, живые или инактивированные вакцины не предотвращают латенции вирулентных вирусов в организме животных [2].

Иммунизация телят специфическими гипериммунными сыворотками требует значительных затрат и времени. Кроме того, они могут быть контаминированы многочисленными возбудителями, в частности, вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Пассивная иммунизация может быть преодолена высоко вирулентными вирусами инфекционного ринотрахеита в ассоциации с аденовирусной и респираторно-синцитиальной инфекциями.

Использование многочисленных иммунотропных препаратов также представляет серьезную проблему. Так, длительное применение иммуностимуляторов, иммуномодуляторов или иммунокорректоров вызывает активацию T- и B-клеточного иммунитета. Это может привести в дальнейшем к запуску опухолевой трансформации клеток, механизм которой тот же, что и активация клеток иммунной системы [3]. Предпочтительными в качестве иммунокорректоров являются растительные вещества из местных видов сырья, так как биотрансформация растительных препаратов требует меньших энергетических затрат, чем обезвреживание веществ животного или синтетического происхождения.

Известны способы лечебно-профилактического воздействия с применением биологически активных веществ растительного происхождения - фитонцидов. Из всех известных фитонцидах наиболее изучены эфирные масла, которые обладают антимикробной активностью в отношении многих групп микроорганизмов. Так, терпеновые соединения эфирных масел чабреца, шалфея, эфиромасличной розы, лесной мяты, тысячелистника, настурции, лаванды и петуньи активны в отношении стрептококка, гемофилюса, кишечной палочки, при этом резистентными к этим соединениям являются клебсиеллы, синегнойная палочка и вульгарный протей [4]. Выявлено иммуномодулирующее влияние эфирных масел на организм человека и животных, которое распространяется на основные звенья иммунитета. Так, использование масла амаранта за 10 дней до вакцинации вакциной «Комбовак-Р» способствует формированию у телят более напряженного клеточного и гуморального группового иммунитета к ПГ-3, ИРТ, ВД-БС [5]. При этом часть эфиромасличных растений ингибирует антителогенез, а другая - стимулирует производство антител. Однако ингаляционное применение эфирных масел в виде аэрозолей имеет следующие недостатки: раздражающее действие на ткани и особенно слизистые оболочки, плохая растворимость в водных средах, что обусловливает медленное всасывание и инактивацию в желудочно-кишечном тракте, возможные аллергические реакции, возникновение отеков и бронхоспазм.

В качестве аналогов нами рассматриваются способы профилактики респираторных болезней телят с применением листьев мать-и-мачехи и травы и соцветий эхинацеи пурпурной, широко используемых в ветеринарной практике. Листья мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) содержат слизь, дубильные вещества, аскорбиновую кислоту, каротин, горький гликозид туссилгин, инулин, органические кислоты и другие вещества. Препараты из листьев растения обладают выраженным отхаркивающим, дезинфицирующим и противовоспалительным действием, которые зависят от наличия эфирных масел и слизистых веществ. Листья растения применяют в форме настоя (1:10) внутрь в качестве отхаркивающего и обволакивающего средства при заболеваниях дыхательных путей [6]. Эхинацея пурпурная (Echinaceae purpurea Moench) содержит уникальный комплекс биологически активных веществ (полисахариды, полифенолы и биофлавоноиды с выраженной антиоксидантной активностью), богата на сбалансированный по незаменимым аминокислотам белок, служит накопителем селена, цинка и других микро- и макроелементов. Совокупность всех составных обеспечивает способность препаратов эхинацеи проявлять иммуно- и биостимулирующие свойства [7].

Задачей изобретения является неспецифическая иммунопрофилактика респираторных болезней телят вирусно-бактериальной этиологии путем коррекции и сохранения в пределах физиологической нормы активности иммунной системы и показателей естественной резистентности.

Эта задача решена использованием для повышения активности иммунной системы аэрозоля корригирующего препарата, содержащего 3,5% водный раствор биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку, состоящую из смеси почек сосны (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1, получившего название фитадез, и гидрохлорида ксимедона.

Используемые ингредиенты фитадеза широко применяются в фитотерапии. Обоснованием для выбора компонентов композиции послужили данные о фармакологических свойствах и химическом составе лекарственного растительного сырья. Каждый компонент содержит биологически активные вещества, воздействующие одновременно на все звенья патогенеза, симптоматику воспалительных заболеваний респираторных органов, а также обладающие выраженным антимикробным действием на патогенную и условно патогенную микрофлору.

Почки сосны (Gemmue Pini) обладают дезинфицирующим, фитонцидным, отхаркивающим, витаминным и успокаивающими свойствами, эффективно предотвращают распространение микробной и вирусной инфекции в организме.

Трава и соцветия эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.) обладают иммуномодулирующей активностью, подавляют активность гиалуронидазы -фермента, способствующего повышению проницаемости для вирусов и микробов, увеличивают противомикробную активность лейкоцитов, макрофагов и нейтрофилов крови и повышают синтез защитных антител и эндогенного интерферона.

Корневища и корни девясила высокого (Inula Neleium L.) обладают противовоспалительным, антимикробным, бактерицидным, противогрибковым, кровоостанавливающим, отхаркивающим свойствами.

Химический состав лекарственного средства представлен комплексом биологически активных веществ, обеспечивающих его высокий фармакотерапевтический эффект. Доминирующими биологически активными веществами являются: эфирное масло, фенольные соединения, флавоноиды, полисахариды, витамины, микроэлементы, главными из которых можно считать цинк, селен и железо.

Флавоноиды (содержат все компоненты) ингибируют фермент катехол-орто-метилтрансферазу и обеспечивают адаптационно-трофическую функцию организма за счет адренопролонгирующего эффекта. Флавоноиды обладают P-витаминной (капилляроукрепляющей) активностью. В суммарном противовоспалительном эффекте флавоноидов имеет значение их непосредственное действие на клеточные и тканевые мембраны - снижение их проницаемости, уплотнение мембран лизосом, ингибирование гиалуронидазы, антагонистическое действие по отношению к медиаторам воспаления /8/.

Полисахариды (содержат все компоненты) оказывают противовоспалительное, иммунокорригирующее действие. Они стимулируют неспецифический иммунитет и фагоцитоз, деятельность макрофагов и нейтрофилов, а также бактерицидную функцию клеток.

Эфирные масла (содержат все компоненты) отличают несколько видов активности (противомикробная, противовоспалительная, спазмолитическая и отхаркивающая), детали и степень которых варьирует. Так, противомикробное действие имеет широкий спектр и носит неспецифический характер. Механизм его сложен и состоит в деструкции цитоплазматической мембраны бактерий с последующим нарушением обмена, аэробного дыхания, процесса синтеза. Противовоспалительная активность проявляется в защите клеток от дальнейшего повреждения, в ослаблении экссудативной фазы процесса, в лейкоцитарной и макрофагальной инфильтрации, в усилении пролиферации клеток. Частично она обусловлена антиоксидантным эффектом, в результате стабилизируются лизосомальные, митохондриальные и цитоплазматические мембраны, снижается проницаемость капилляров, и одновременно усиливается фагоцитарная активность макрофагов и лейкоцитов.

Фенольные соединения (содержат все компоненты) оказывают противомикробное действие, механизм которого обусловлен их способностью сорбироваться компонентами цитоплазматической мембраны бактерий, образовывать прочные водородные связи с белками и повреждать мембрану, в частности повышая ее проницаемость для ионов(прежде всего калия) и важных метаболитов, теряемых клеткой, а также для воды, поступающей извне и способствующей лизису.

Витамины (витамин C - почки сосны обыкновенной, эхинацея пурпурная; витамин E - девясил высокий, витамин A - эхинацея пурпурная) участвуют во всех процессах обмена веществ, повышают устойчивость организма к заболеваниям, оказывают противовоспалительное действие, способствуют дезинтоксикации организма.

Микроэлемент цинк (почки сосны обыкновенной, девясил высокий) участвует в организме в иммунных процессах, селен (девясил высокий, который концентрирует селен, почки сосны обыкновенной) является мощным антиоксидантом, а железо (эхинацея пурпурная) - основным структурным компонентом гемоглобина крови и гемсодержащих ферментов.

Все растения фитадеза обладают противомикробным действием, а трава и соцветия эхинацеи пурпурной - вируснейтрализующим свойством, почки сосны предотвращают распространение вирусной инфекции в организме, что обеспечивает устранение (ослабление) причин болезни, противовоспалительное (девясил высокий, эхинацея пурпурная), отхаркивающее (почки сосны), спазмолитическое (девясил высокий) действие уменьшает патогенетические изменения, а иммуномодулирующая активность эхинацеи пурпурной усиливает защитные, компенсаторно-приспособительные механизмы организма.

Высокая эффективность фитадеза достигается благодаря сочетанию целого комплекса биологически активных веществ, вследствие чего наблюдается взаимное усиление полезных фармакологических свойств каждого отдельного компонента.

Фитадез готовится следующим образом.

Почки сосны обыкновенной (Gemmue Pini), траву и соцветия эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L), корневища и корни девясила высокого (Inula Neleium L.) измельчают (в сухом виде) согласно Государственной Фармакопеи и смешивают в соотношении 2:1:1. Сырье помещают в стеклянный сосуд и смачивают, заливая извлекателем (70% спиртом) в соотношении 1:5. Слив готового продукта получают через 7 дней. Готовый продукт хранят в темном месте при температуре 5-10°C. Срок годности - 2 года со дня изготовления.

В соответствии с классификацией токсичности веществ по ГОСТу 12.1.007-88 средство может быть оценено как относительно безопасное, поскольку при определении параметров острой токсичности на мышах весом 20,0 г его 20% и 40% водные растворы показали ЛД₅₀ более 17,8 г/кг массы тела, а при внутриутробном введении - более 3,0 г/кг массы тела.

Пример: 100 г почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), 50 г травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.) и 50 г корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) измельчили, смешали, поместили в стеклянный сосуд, залили 1 л этилового спирта 70% концентрации и выдержали при температуре 18-20°C в темном месте в течение 7 дней. Готовый продукт слили, лекарственное сырье отжали и отфильтровали.

Гидрохлорид 1-(2-гидроксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидропиримидин-2-она (гидрохлорид ксимедона) - иммуномодулятор с выраженным регенераторным действием. Согласно медицинским данным ксимедон проявляет иммуномодулирующее, анаболическое, ангиопротективное и противовоспалительное действие. Применяется для коррекции иммунодефицитов и в составе комплексной терапии ожогов и ран.

Способ осуществляется следующим образом.

Клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста обрабатывают аэрозолем корригирующего препарата, содержащего 100 мл 3,5% водного раствора биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1, и 4 г гидрохлорида ксимедона, из расчета 3,0-5,0 мл/м³ в течение 40-45 минут трехкратно с интервалом в 72 часа. Аэрозольную обработку животных проводят в специально оборудованной герметичной камере, оснащенной канализацией и приточно-вытяжной вентиляцией. Для получения высокодисперсных аэрозолей используют сверхзвуковую аэрозольную форсунку САФ производительностью не менее 200 мл/мин при дисперсности генерируемого аэрозоля от 5 до 25 мкм. Обработку осуществляют при температуре воздуха 14°C и относительной влажности не ниже 70%. Стабильность аэрозолей обеспечивают добавлением 10-20% стерильного глицерина или 10% глюкозы в порошке к общему объему рабочего раствора.

Эффективность способа профилактики респираторных болезней телят полиэтиологической природы определяли в научно-производственных опытах в условиях хозяйства, длительно неблагополучного по респираторным болезням, обусловленным воздействием на организм ассоциаций вирусов, патогенной и условно патогенной микрофлоры на фоне нарушения условий содержания и кормления стельных коров и телят. Вирусологическими и бактериологическими исследованиями подтверждена этиологическая роль вирусов ПГ-3, ИРТ, ВД-БС, пастерелл, сальмонелл, протея и эшерихий. Заболеваемость - 60-80%, летальность - до 20%. Для оценки иммунного статуса клинически здоровых телят в условиях стационарного неблагополучия по смешанным респираторным болезням провели иммунологический мониторинг по следующим показателям: относительное содержание Т-лимфоцитов (определяли в реакции спонтанного розеткообразования по методу Н.И. Блинова, (1980)), функциональная активность нейтрофилов крови (определяли в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) по методу М.Е. Виксмана и A.M. Маянского, (1979)), лизоцимная активность сыворотки крови (определяли по методу В.Г. Дорофейчук, (1969)). Выбор иммунонологических показателей основан на том, что по результатам наших исследований иммунодефицитное состояние при смешанных вирусно-бактериальных респираторных инфекциях характеризуется дефектами клеточного звена иммунитета, фагоцитоза и снижением естественной резистентности. Результаты иммунологического мониторинга представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, у клинически здоровых телят выявлена легкая степень иммунодефицита, характеризующаяся снижением относительного содержания Т-лимфоцитов на 12,5%, функциональной активности нейтрофилов крови в спонтанном и индуцированном тестах на 17 и 13% соответственно, лизоцимной активности сыворотки крови на 21% от минимального значения физиологической нормы данного возрастного периода.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для обоснования дозы корригирующего препарата в соответствии с изобретением формировали 5 групп клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста: 4 группы - опытные, 1 группа - контрольная. Телят опытных групп обрабатывали аэрозолем корригирующего препарата, содержащего 100 мл 3,5% водного раствора биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinaceapurpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1, и 4 г гидрохлорида ксимедона, в течение 45 минут трехкратно с интервалом в 72 часа из расчета 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мл/м³ помещения. Телята контрольной группы препаратов не получали. Взятие крови у животных для исследований проводили до обработок (фон) и спустя 7-10 дней после завершения опытов. Иммунный статус оценивали по основным иммунологическим показателям. Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, корригирующий препарат в соответствии с изобретением оказывал стимулирующее влияние на исходно сниженные иммунобиологические показатели клинически здоровых телят. Так, применение корригирующего препарата в соответствии с изобретением способствовало достоверному увеличению относительного содержания T- и B-лимфоцитов крови, функциональной активности нейтрофилов крови и лизоцимной активности сыворотки крови. Проведенные исследования подтвердили обоснованность заявленных доз. Дозы корригирующего препарата в соответствии с изобретением ниже минимальной и выше максимальной нецелесообразны. Так, в первой группе (доза ниже минимальной) различия были недостоверными, а в четвертой группе (доза выше максимальной) значения иммунобиологических показателей практически не отличались от значений соответствующих показателей в третьей группе.

Пример 2. Для обоснования эффективности корригирующего препарата в соответствии с изобретением в отношении иммунного статуса телят формировали четыре группы клинически здоровых телят 20-дневного возраста: 2 группы - опытные, 1 группа - контрольная. Телят опытных групп обрабатывали в течение 40 минут трехкратно с интервалом в 72 часа из расчета 4,0 мл/м³ помещения аэрозолем корригирующего препарата, содержащего 100 мл 3,5% водного раствора биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1, и 4 г гидрохлорида ксимедона (первая опытная группа) и аэрозолем 3,5% водного раствора биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1 (вторая опытная группа), аэрозолем гидрохлорида ксимедона (третья опытная группа). Телята контрольной группы препаратов не получали. Учет результатов, как в примере 1. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, композиция биологически активных препаратов (фитадез + гидрохлорид ксемидона) проявляла свойства, отличные от свойств каждого из препаратов в отдельности. Гидрохлорид ксемидона и фитадез оказывали более выраженное влияние на гуморальное звено иммунитета, о чем свидетельствовала динамика основных показателей. Так, отмечали увеличение относительного содержания В-лимфоцитов на 54,4% в третьей опытной группе и на 47,1% во второй опытной группе по сравнению с 33,3% в первой опытной группе; содержания IgG - на 30% в третьей опытной группе, на 17,6% во второй опытной группе по сравнению с 13,7% в первой опытной группе; содержания IgM - в 2 раза в третьей опытной группе, на 66,7% во второй опытной группе по сравнению с 44,4% в первой опытной группе. Корригирующий препарат в соответствии с изобретением стимулировал клеточное звено иммунитета. Так, относительное содержание Т-лимфоцитов увеличилось на 36,7% в первой опытной группе по сравнению с 14,5% во второй и 14,6% в третьей опытной группе. Корригирующий препарат в соответствии с изобретением обеспечивал более выраженное повышение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов крови и лизоцимной активности сыворотки крови. Так, фагоцитарная активность нейтрофилов в первой опытной группе повышалась в спонтанном тесте на 29,7% по сравнению с 12,2% во второй опытной группе и 21,7% в третьей опытной группе, в индуцированном тесте - на 31,8% по сравнению с 10,5% и 7,7% соответственно. Лизоцимная активность сыворотки крови увеличилась в первой опытной группе на 81,8% по сравнению с 33,3% во второй и 63,6% в третьей опытной группе.

Пример 3. Для подтверждения эффективности заявленного способа профилактики респираторных болезней телят вирусно-бактериальной этиологии формировали 4 группы клинически здоровых телят 20-дневного возраста. Схемы профилактических обработок по группам: первая группа - обработка аэрозолем корригирующего препарата, содержащего 100 мл 3,5% водного раствора биологически активного комплекса, представляющего собой 70% спиртовую настойку почек сосны обыкновенной (Gemmue Pini), травы и соцветий эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L), корневищ и корней девясила высокого (Inula Neleium L.) в соотношении 2:1:1, и 4 г гидрохлорида ксимедона, из расчета 4,5 мл/м³ помещения в течение 45 минут трехкратно с интервалом в 72 часа (заявленный способ); вторая группа - обработка аэрозолем настойки мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) из расчета 3 мл/м³ помещения в течение 60 минут трехкратно с интервалом в 48 часов (способ-аналог); третья группа - обработка аэрозолем 7% раствора настойки эхинацеи пурпурной (Ehinacea purpurea L.) из расчета 3 мл/м помещения в течение 60 минут трехкратно с интервалом в 48 часов (способ-аналог); четвертая группа - обработка аэрозолем йодтриэтиленгликоля в сочетании с молочной кислотой из расчета 1 мл/м в течение 30 минут тремя трехдневными курсами с интервалом между ними в 48 часов (базовый способ). Наблюдение вели в течение 14 дней, учитывали физиологическое состояние, заболеваемость, характер течения болезни, продолжительность и исход. Заболевших телят лечили симптоматическими средствами, в том числе антибактериальными. Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, заявленный способ обеспечивал оптимальный профилактический эффект, который выражался в снижении числа заболевших телят и более легкой форме переболевания. Снижение заболеваемости свидетельствовало об усилении резистентности, что указывало на повышение адаптационного уровня. После выздоровления телята хорошо развивались, у них восстанавливались реакции на внешние раздражители, они были подвижны и активны.

Проведенные исследования подтвердили эффективность заявленного способа профилактики респираторных болезней телят вирусно-бактериальной этиологии не только стимуляцией клеточного звена иммунитета и повышением естественной резистентности, но и разрывом эпизоотической цепи «вирус-восприимчивое животное». Так, при определении бактериальной обсемененности воздуха животноводческих помещений до и после обработки телят заявленным способом установили, что общая микробная загрязненность воздуха до обработки составила 102,5±7,1 тыс.КОЕ/ м³ воздуха, после обработки - 31,7±4,6 тыс. КОЕ/м³ воздуха, т.е. понизилась на 69%.

Источники информации

1. http:veterinarua.ru

2. Ветеринарная вирусология / Сюрин В. [и др.]. - М: Агропромиздат, 1991. - 431 с.

3. Агеенко А.И. Механизмы вирусного онтогенеза. - М.: Медицина, 1978. - 328 с.

4. Детская пульмонология. Принципы терапии / Зосимов А.Н., Родзицкая В.К., Черкасов С.А. - М.: Эксмо, 2008. - С. 489-494.

5. Использование амарантового масла при специфической профилактике респираторных болезней телят / О.А. Манжурина [и др.] // Вестник ветеринарии. - 2012. - №4 (63). - С. 139-141.

6. Лекарственные средства в ветеринарии / Д. Червяков [и др.]. - М.: Колос, 1977. - С142.

7. Заплатников А.Л. Иммунопрофилактика и иммунотерапия острых респираторных инфекций // Лечащий врач. - 2006. - №9. - С. 50-56.