СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ III СТАДИИ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни.

Гипертоническая болезнь представляет собой наиболее широко распространенное сердечно-сосудистое заболевание среди населения трудоспособного возраста [Mancia G., Fagard R., Narkiewicz K., 2013. ESH/ESC guidelines for the management of arterial hypertension. Journal of Hypertens, 31, (7): 1281-1357]. Известно, что гипертоническая болезнь III стадии характеризуется развитием ассоциированных (сопутствующих) клинических состояний и представляет собой один из наиболее значимых факторов риска развития инфаркта миокарда, острых нарушений мозгового кровообращения, которые характеризуются высокой и ранней инвалидизацией, а также преждевременной смертностью больных, что объясняет большую социальную значимость данной патологии [Lubna A. Al-Ansary, Andrea C. Tricco, Sharon E. Straus. A Systematic Review of Recent Clinical Practice Guidelines on the Diagnosis, Assessment and Management of Hypertension. PLoS One. 2013; 8 (1): 537-44].

Поэтому возможность прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни позволит оптимизировать индивидуальную тактику ведения этих пациентов с гипертонической болезнью, направленную на предупреждение развития III стадии заболевания.

Гипертоническая болезнь представляет собой мультифакториальное заболевание с выраженным генетическим компонентом. Согласно экспериментальным и клиническим данным, существенный вклад в развитие данного заболевания вносят цитокины, участвующие в воспалительном процессе и механизмах апоптоза. Среди цитокинов особого внимания заслуживают фактор некроза опухоли альфа (TNFα).

TNFα - многофункциональный цитокин, который синтезируется активированными макрофагами, моноцитами, нейтрофилами, дендритными клетками, Т- и В-лимфоцитами, эндотелиальными, гладкомышечными клетками, натуральными киллерами и тучными клетками [Hollegaard, M.V. Cytokine gene polymorphism in human disease [Text] /M.V. Hollegaard, J.L. Bidwell //Genes Immun. - 2006. - Vol.7. - Suppl. 3. - P. 269-276]. Он задействован в регуляции широкого спектра биологических процессов, таких как пролиферация, дифференцировка клеток [Waters J. P., Pober J. S., Bradley J. R., 2013. Tumour necrosis factor in infectious disease. J. Pathol., 230 (2): 132-147], оказывает влияние на инсулинорезистентность, функцию эндотелия, метаболизм липидов [The -308G/A of tumor necrosis factor (TNF)-α and 825C/T of guanidine nucleotide binding protein 3 (GNB3) are Associated with the Onset of Acute Myocardial Infarction and Obesity in Taiwan [Text] /W.-T. Chang, Y.-C. Wang, C.-C. Chen [et al.] //Int. J. Mol. Sci. - 2012. - Vol.13, №2. - P. 1846-1857], принимает участие в регуляции апоптоза (запрограммированная гибель клеток), а также активирует процессы оксидативного стресса кардиомиоцитов [Елисеев, М. С. Роль фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) в развитии обменных нарушений и атеросклероза и влияние на них ингибиторов ФНО-α у больных ревматическими заболеваниями [Текст] /М. С. Елисеев, В. Г. Барскова, Е. Л. Насонов //Научно-практическая ревматология. - 2009. - №2. - С. 67-72].

Ген, кодирующий белок TNFα, включает 4 экзона и 3 интрона и картируется в геноме человека на коротком плече шестой хромосомы (6p21.3), располагаясь рядом с генами главного комплекса гистосовместимости [Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Alfa Genetic Polymorphisms and Outcome in Pediatric Patients With Non-Hodgkin's Lymphoma: Results From Berlin-Frankfurt-Münster Trial NHL-BFM 95 [Text] /K. Seidemann [et al.] //Journal of Clinical Oncology. - 2005. - Vol.23. - №33. - P. 8414-8421]. Самым распространенным видом мутаций гена TNFα являются однонуклеотидные замены в промоторном регионе. Некоторые аллельные варианты этого гена увеличивают связывание транскрипционных факторов с промотором и активируют транскрипцию, что в последующем приводит к возрастанию экспрессии TNFα [Tumоr nесrоsis fасtоr аlрhа-308 аnd lymрhоtохin аlрhа+252 gеnеtiс роlymоrрhisms аnd thе susсерtibility tо nоn-Hоdgkin lymрhоmа in Еgyрt [Tехt] /А. Ibrаhim, H. Аbdеl Rаhmаn, M. Khоrshiеd [еt аl.] //Lеuk. Rеs. - 2012. - Vоl. 36, №6. - Р. 694-698].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития III стадии у больных гипертонической болезнью на основе данных о генетическом полиморфизме -308G/A TNFα и других предикторах развития заболевания.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров гена TNFα.

В патенте РФ №2329503 (дата публикации 20.07.2008) предложен способ оценки риска прогрессирования артериальной гипертензии у женщин, заключающийся в заборе крови и анализе биохимических параметров энергетического метаболизма эритроцитов, по результатам которого в зависимости от возраста женщин по прогностическим таблицам определяют процент риска утяжеления течения гипертонической болезни в ближайшие 5 лет.

Недостаток метода заключается в сложности анализа и низкой доступности использованного оборудования, кроме того, данный способ применим только для женщин и не рассматриваются генетические полиморфизмы прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни.

За прототип выбран патент РФ №2456608 (дата публикации 20.07.2012) «Способ прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин». Заявляемый способ включает выделение геномной ДНК из периферической венозной крови пациентов, выявление полиморфных вариантов генов и позволяет прогнозировать развитие гипертонической болезни на основе генотипирования полиморфных локусов генов флавиновой монооксигеназы 3 типа, цитохрома Р-450 1 В1, N-ацетилтрансферазы 2 типа и анализа средовых факторов риска, таких как характер употребления алкоголя, факт курения и наличие контакта с вредными химическими веществами, с использованием логистического регрессионного анализа.

Недостаток метода заключается в том, что он рассматривает риск развития гипертонической болезни только у мужчин, а согласно литературным данным гипертоническая болезнь развивается чаще у женщин [Эпидемиология артериальной гипертонии в России. Результаты федерального мониторинга 2003-2010 гг. /Р.Г. Оганов [и др.] //Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2011. - №1. - С. 9-13]. Кроме того, не рассматриваются гены-кандидаты, связанные с воспалительным механизмом развития гипертонической болезни и ее течения и не определяются риски развития ассоциированных клинических состояний, т.е. III стадии.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики III стадии гипертонической болезни, а именно создание способа прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни на основе данных о генетическом полиморфизме -308G/A TNFα и других предикторах развития заболевания.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки прогноза развития III стадии гипертонической болезни у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- определение полиморфных вариантов гена -308G/A TNFα;

- прогнозирование риска развития III стадии гипертонической болезни в зависимости от выявленных вариантов по локусу -308G/A TNFα и других предикторов развития данного заболевания по уравнению логистической регрессии следующего вида:

у=11-0,399 x₁-0,255 x₂+1,290 x₃-0,419 x₄+0,912 x₅-1,156 x_6,

где x₁ - длительность заболевания, лет; x₂ - индекс массы тела, кг/м²; x₃ - наличие метаболического синдрома (нет - x₃=1, да - x₃=2); x₄ - холестерин, ммоль/л; x₅ - липопротеины низкой плотности, ммоль/л, x₆ - генетический вариант по локусу -308G/A TNFα (AA - x₆=1, AG - x₆=2, GG - x₆=3).

- прогнозирование высокого риска развития III стадии гипертонической болезни в случае, если величина у выше 0,50.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития III стадии гипертонической болезни по наличию генетических вариантов по локусу -308G/A TNFα в сочетании с вышеуказанными предикторами.

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мклпротеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ полиморфизма -308G/A TNFα осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей (фиг.1). Для дискриминации аллелей используют программу Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».

Генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю A.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси y) на диаграмме дискриминации аллелей.

• Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси y).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля A отложены по оси x).

• Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах:

фиг. 1, где представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFα, где ○ - гомозиготы -308АА, □ - гомозиготы -308GG, ∆ - гетерозиготы -308GA, ◊ - отрицательный контроль.

фиг. 2, где в таблице представлены коэффициенты логистической регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования III стадии гипертонической болезни.

Возможность использования предложенного способа прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни подтверждает анализ результатов наблюдений 452 индивидуумов: 143 больных гипертонической болезнью с III стадией заболевания и 309 пациентов, имеющих I и II стадии гипертонической болезни.

Критерии включения в исследуемые выборки:

1. Индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой.

2. Добровольное согласие пациентов на проведение исследования.

3. В группу больных включались индивидуумы после установления диагноза гипертоническая болезнь, который подтверждался клиническими и лабораторно-инструментальными методами обследования, в соответствии с обязательными диагностическими стандартами, рекомендованными ВНОК [Рекомендации ВНОК, 2010].

Критерии исключения из исследуемых выборок:

1. Пациенты с симптоматическими артериальными гипертензиями.

2. Наличие тяжелой соматической патологии (печеночная, почечная недостаточность, аутоиммунные и онкологические заболевания).

3. Больные нерусской национальности, родившиеся вне Центрального Черноземья России.

4. Индивидуумы, отказавшиеся от проводимого исследования.

Клиническое и лабораторное обследование индивидуумов проводилось на базе кардиологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Разработана математическая модель прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни с использованием метода бинарной логистической регрессии [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] /О.Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.: ил.; Боровиков, В.П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст] /В.П. Боровиков. - 2-е изд. - Санкт-Петербург: Питер, 2003. - 688 с.].

При проведении логистической регрессии построена следующая статистическая модель прогнозирования риска развития III стадии гипертонической болезни, включающая следующие факторы: генетический вариант по локусу -308G/A TNFα, длительность заболевания, индекс массы тела, наличие метаболического синдрома, уровень холестерина и липопротеинов низкой плотности (фиг.2). Уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск развития III стадии гипертонической болезни. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляет 32,45, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения i-го признака шанс возникновения III стадии гипертонической болезни увеличивается более чем в 32 раза.

С помощью полученных коэффициентов логистической регрессии, на основе данных о генетических вариантах локуса -308G/A TNFα, длительности заболевания, индекса массы тела, наличия метаболического синдрома, уровня холестерина и липопротеинов низкой плотности можно прогнозировать риск развития III стадии гипертонической болезни.

Уравнение логистической регрессии имеет следующий вид [Реброва, О.Ю., 2006]:

y=b₀+b₁х₁+b₂х₂+b₃х₃+…+b_nх_n,

где х₁-х_n информативные признаки (факторы риска), b₀-b_n- регрессионные коэффициенты для данных признаков.

P=е^y/(1+е^y),

где е - математическая константа, приблизительно равная 2,72.

В нашем случае уравнение логистической регрессии будет следующим:

у=11-0,399 x₁-0,255 x₂+1,290 x₃-0,419 x₄+0,912 x₅-1,156 x_6,

где x₁ - длительность заболевания, лет; x₂ - индекс массы тела, кг/м²; x₃ - наличие метаболического синдрома (нет - x₃=1, да - x₃=2); x₄ - холестерин, ммоль/л; x₅ - липопротеины низкой плотности, ммоль/л, x₆ - генетический вариант по локусу -308G/A TNFα (AA - x₆=1, AG - x₆=2, GG - x₆=3).

С целью проверки работоспособности модели в анализ были дополнительно включены двое больных гипертонической болезнью русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья. У пациента А. определены следующие показатели: длительность заболевания - 7 лет (x₁), индекс массы тела - 32,0 кг/м² (x₂), наличие метаболического синдрома - да (x₃=2), холестерин - 6,0 ммоль/л (x₄), липопротеины низкой плотности - 4,5 ммоль/л (x₅), генетический вариант локуса -308G/A TNFα - AA (x₆=1).

Для пациента В. были определены следующие показатели: длительность гипертонической болезни - 10 лет (x₁), индекс массы тела - 31,2 кг/м² (x₂), наличие метаболического синдрома - нет (x₃=1), холестерин - 5,4 ммоль/л (x₄), липопротеины низкой плотности - 2,6 ммоль/л (x₅), генетический вариант локуса -308G/A TNFα - GG (x₆=3).

Подставив значения соответствующих показателей в уравнение регрессии, получим для пациента А.:

у=11-0,399*7-0,255*32,0+1,290*2-0,419*6,0+0,912*4,5-1,156*1=3,061

соответственно P=2,72^3,061/(1+2,72^3,061)=0,9553, т.е. вероятность риска развития III стадии гипертонической болезни у пациента А. высокая, т.к. значение у выше 0,50.

Для пациента В.:

у=11-0,399*10-0,255*31,2+1,290*1-0,419*5,4+0,912*2,6-1,156*3=-3,0774,

соответственно P=2,72^-3,0774/(1+2,72^-3,0774) или (1/2,72^3,0774) /1+(1/2,72^3,0774)=0,0460, т.е. вероятность риска развития III стадии гипертонической болезни у пациента В. крайне мала, т.к. значение у ниже 0,50.

Таким образом, можно заключить, что данная модель логистической регрессии работоспособна и позволяет эффективно прогнозировать риск развития III стадии гипертонической болезни, т.е. ассоциированных клинических состояний, в зависимости от генетических вариантов фактора некроза опухоли α, длительности заболевания, индекса массы тела, наличия метаболического синдрома, уровня холестерина и липопротеинов низкой плотности с целью определения тактики ведения пациента с гипертонической болезнью для предотвращения развития ассоциированных клинических состояний.