Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной онкологии, и может быть использовано для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения.

Известны средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способы диагностики заболевания с использованием этих средств.

В частности, известен набор для серологической диагностики, содержащий антиген вируса лейкоза, разбавитель антигена вируса лейкоза, специфическую преципитирующую сыворотку, солевую смесь агара, разбавитель солевой смеси агара (см. ).

Набор предназначен для постановки реакции иммунодиффузии, которую проводят в геле агара с целью выявления антител против гликопротеидного антигена вируса лейкоза.

Однако, реакция иммунодиффузии (РИД) не позволяет выявить животных-вирусоносителей, титр антител которых недостаточен для их идентификации.

На решение задачи выявления животных-вирусносителей с помощью реакции РИД с использованием данного набора направлен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС), заключающийся в использовании инактивированной вакцины против лейкоза КРС, которую вводят трехкратно с интервалом 14 дней в дозе 2 мл (см. патент РФ №2264628 по кл. МПК G01N 33/53, опуб. 20.11.2005). Способ позволяет выявлять животных-вирусоносителей среди серонегативных коров и телок старше пятимесячного возраста. Данный способ заключается в повторном серологическом исследовании в РИД после провокации иммунного ответа путем трехкратного введения инактивированной вакцины.

Однако, любая провокация иммунного ответа приводит к выработке значительного количества антител, что может привести к необратимым изменениям организма животных и в, конечном итоге, их гибели.

Известен также набор для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, предназначенный для проведения иммуноферментного анализа (см. там же: http://www.biok.ru/vet_diagn).

Набор содержит 11 компонентов:

- компонент №1 - полистироловый 96-луночный цельный или стрипованный планшет с иммобилизованным в лунках гликопротеидным антигеном (gp51) BLV;

- компонент №2 - сыворотка крови крупного рогатого скота, содержащая антитела к gp51 BLV (положительный контроль);

- компонент №3 - сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к gp51 BLV (отрицательный контроль);

- компонент №4 - молоко, содержащее антитела к gp51 BLV (положительный контроль);

- компонент №5 - молоко, не содержащее антител к gp51 BLV (отрицательный контроль);

- компонент №6 - антивидовой конъюгат (моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой);

- компонент №7 - концентрат (×20) буферного раствора для разведения контрольных и испытуемых проб сывороток крови и конъюгата;

- компонент №8 - концентрат (×20) промывочного буферного раствора;

- компонент №9 - раствор субстрата (Н202);

- компонент №10 - раствор хромогена (ТМБ);

- компонент №11 - стоп-раствор (0,2 Μ раствор серной кислоты).

Набор предназначен для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови и молоке крупного рогатого скота иммуноферментным методом (ИФА) (см. «Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота». МСХ РФ, Департамент ветеринарии №13-7-2/2130 от 23.08.00).

Известен также способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного анализа (см. патент РФ №2425377 по кл. МПК G01N 33/487, опубл. 27.07.2011), заключающийся в предварительной перед проведением ИФА инкубации пробы обезжиренного молока или сыворотки крови, что повышает чувствительность ИФА диагностики до 20%.

Иммуноферментный метод обладает значительными преимуществами перед РИД: более высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью автоматизации процесса и сокращения времени анализа.

Однако, набор и метод проведения ИФА с его помощью не позволяет выявлять антитела, которые могут быть нейтрализованы вирусом лейкоза в сыворотке крови и молоке инфицированных животных.

Известны средства и методы диагностики лейкоза КРС путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводят в случаях, когда серологическими методами животные не выявляются, например, когда инфекция протекает «атипично» - без образования антител.

В частности, известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (см, патент РФ №2445370 по кл. МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012), заключающийся в использовании олигонуклеотидных праймеров определенной структуры для выявления фрагмента гена pol повируса лейкоза КРС.

Однако, проведение ПЦР является очень дорогостоящим методом. Более того, эффективность ПЦР составляет от 58,3 до 72,6% (см., например, Двоеглазов Н.Г. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота // Материалы диссертации - Новосибирск. - 2009 г, опубликована на сайте otsenka-effektivnosti-razlichnyh-metodov-diagnostiki-infektsii-virusa-leykoza-krupnogo-rogatogo-skota#ixzz3Ap0vf1Rx).

Наиболее близким к заявляемому является средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее белковую фракцию вируса лейкоза (гликопротеидный антиген gp51), используемое для проведения иммуноферментного анализа (см. ).

Однако, данный белковый компонент используется только в наборе для проведения иммуноферментного анализа. Сам набор многокомпонентен, а способ диагностики с использованием этого набора длителен и трудоемок в реализации.

Изобретение направлено на решение задачи расширения спектра диагностических препаратов и формирования новых подходов к проблеме диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Достигаемый при этом технический результат заключается в создании простого и недорогого средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющего быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.

Указанный технический результат в части самого средства достигается тем, что средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее водорастворимую белковую фракцию, согласно изобретению, в качестве водорастворимой белковой фракции содержит белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Указанный технический результат в части способа применения этого средства достигается тем, что способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25%-0,5% концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством, представляющим собой водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %: белковая фракция - 0,49-0,52 мас. % и фосфатно-солевой буферный раствор - остальное.

Указанные признаки являются существенными и достаточными для получения требуемого технического результата.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе водорастворимой белковой фракции клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющей молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующейся наличием пиков при длине волны 214 нм, содержащее дополнительно фосфатно-солевой буферный раствор при определенных соотношениях компонентов.

Также неизвестны способы диагностики лейкоза КРС, основанные на агглютинирующей способности взаимодействия двух компонентов: первого - это диагностикума, выполненного на основе водорастворимого белкового компонента из клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и Д (а не эритроцитарного диагностикума, как это общепринято в постановке реакции агглютинации), а в качестве второго компонента выступает кровь больного животного (взвесь цитратной крови определенной концентрации).

Исследования эффективности существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота (РИД, ИФА и ПЦР) показали, что ни один из этих методов не позволяет полностью выявлять всех животных-вирусоносителей (см., например, http://www.pandia.ru/465284). Эффективность РИД составляет 76,1%, ИФА - 83,3%, ПЦР - от 58,3 до 72,6%. В настоящее время для достижения наилучшего диагностического эффекта исследователями предлагается комбинированное использование серологических и генно-молекулярных методов, что увеличивает время проведения и повышает стоимость диагностических исследований.

Известно использование надосадочной жидкости, полученной при культивировании клеток СПЭВ, для экспресс-диагностики онкологических заболеваний человека (см. патент РФ №2383891 по кл. МПК G01N 33/49, опубл. 10.03.2010).

Однако, применение данного способа, в котором в качестве реагента используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании клеток СПЭВ, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота не дало никакого эффекта: реакции взаимодействия как отмытых эритроцитов, так и взвеси цитратной крови с надосадочной жидкостью не было.

Надосадочная жидкость является многокомпонентной структурой, в которой присутствуют и липиды, и полисахариды, и белок.

Именно поэтому была поставлена задача выявления такой белковой фракции, которая взаимодействовала бы (вступала в реакцию агглютинации) с кровью больного животного (эритроцитами - отмытыми и неотмытыми).

В ходе исследований были получены результаты взаимодействия 0,49%-0,52% фосфатно-солевого буферного раствора белковой фракции с молекулярной массой 75-82 кДа, выделенной из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами С и Д, только с неотмытыми эритроцитами (т.е. со взвесью цитратной крови, причем определенной концентрации). При этом полученные результаты совпадали с результатами исследований крови одних и тех-же животных в РИД, ИФА и ПЦР.

Таким образом, авторами найден новый подход к диагностике лейкоза КРС путем использования реакции взаимодействия взвеси цитратной крови (неотмытых эритроцитов) инфицированных животных с белковой фракцией из клеточной линии СПЭВ при постановке диагноза.

Т.е. наряду с существующими методами диагностики лейкоза КРС (проведением серологических и генно-молекулярных исследований) авторами предложен новый подход к решению проблемы диагностики лейкоза КРС - определение инфицированности животных вирусом лейкоза по агглютинирующей способности эритроцитов цитратной крови с белковым компонентом определенной молекулярной массы, выделенным из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами С и Д.

Сказанное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется рис. 1, на котором представлен результат жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC).

Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота готовят следующим образом.

Культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами С и Д, засевают на ростовую питательную среду и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином, который через 3-5 минут сливают и добавляют снова ростовую питательную среду.

Осуществляют подсчет дезинтегрированных клеток и доводят количество клеток в 1 мл среды до 100-120 тысяч.

Эту суспензию клеток помещают в стерильные пробирки и создают анаэробные условия (соотношение питательной среды к воздушной фазе 1:5).

Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя в этих пробирках.

Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку поддерживающую среду.

Помещают пробирки в термостат при 37°С. Через 16-18 часов их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя.

Пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, а остальные пробирки выбраковывают. В результате получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д.

Для исключения артефактов по неспецифическому разрушению монослоя клеток и накопления большего объема суспензии для получения диагностического средства полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчета 20% суспензии и 80% поддерживающей среды с монослоем.

Через сутки пробирки с разрушенным монослоем клеток отбирают. Процедуру повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.

Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, центрифугируют в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.

Затем надосадочную жидкость осаждают солевым раствором (например, сульфатом аммония) в количестве 60% от насыщения, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в минимальном объеме 0,01 Μ фосфатно-солевого буферного раствора при pН 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатно-солевого буфера при рН 7,4 в течение 24 часов. После чего определяют концентрацию белка общепринятыми методами.

Для определения молекулярной массы полученного белка проводили жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC), в частности, на жидкостном хроматографе «Стайер», с использованием спектрофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм). Для разделения использовали колонку BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300×7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатно-солевой буфер, скорость потока составляла 1 мл в минуту.

В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа.

Пример приготовления средства для диагностики лейкоза КРС - №1.

Берут культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами С и Д, в концентрации 100-120 тысяч клеток в 1 мл ростовой питательной среды, засевают культуру на матрасики объемом 50 мл на ростовую питательную среду Игла с добавлением 10% аллогенной сыворотки в количестве 10 мл и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином в соотношении 1:1 в количестве 3-5 мл, которую через 3-5 минут сливают и снова добавляют ростовую питательную среду Игла с 10% аллогенной сывороткой.

Матрасики встряхивают для снятия монослоя, осуществляют подсчет дезинтегрированных клеток и доводят (путем добавления той же ростовой среды) количество клеток в 1 мл среды до концентрации 100-120 тысяч клеток в 1 мл среды.

Эту суспензию клеток в количестве 1 мл помещают в 10 стерильных пробирок Флоринского объемом 5 мл по 1 мл в каждую и создают анаэробные условия (соотношение суспензии к воздушной фазе 1:5).

Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку по 1 мл поддерживающей среды Игла. Помещают пробирки в термостат при 37°С, через 16-18 часов их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя - 2 пробирки. Остальные 8 пробирок выбраковывают.

Отобранные 2 пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, в результате чего получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д, в количестве 2 мл.

Полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию из 10 пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчета 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды.

Через 16-18 часов пробирки с разрушенным монослоем клеток снова отбирают. Процедуру накопления большего объема суспензии повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.

Окончательно берут 120 пробирок, в каждую из которых вносят по 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды с монослоем. В итоге получают 100 мл суспензии.

Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, затем центрифугируют в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.

Берут 100 мл надосадочной жидкости, добавляют 42 г сульфата аммония для осаждения белка, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в 1 мл 0,01 Μ раствора фосфатно-солевого буфера при pН 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01 Μ растворе фосфатно-солевого буфера при рН 7,4 в течение 24 часов, после чего определяют концентрацию белка методом Лоури на биохимическом анализаторе StatFax 3300. Она составляла 5 мг/мл.

Для обоснования граничных значений концентрации белка был проведен ряд экспериментов, аналогично описанному в примере 1. Во всех случаях концентрация белка была в пределах от 4,9 мг/мл до 5,2 мг/мл.

Результаты HPLC - хроматографии показали (см. рис. 1), что основные белки (пики 1 и 2) имели молекулярную массу от 75 до 82 кДа и составляли 93% от всей массы входящих в надосадочную жидкость белков.

В таблице 1 представлен результат жидкостной хроматографии.

Способ применения средства осуществляется следующим образом.

В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.

Из цитратной крови готовят 0,25%-0,5% взвеси на физиологическом растворе.

Постановку реакции осуществляют на специальных планшетах с лунками. Ряды лунок заполняют 0,25%-0,5% взвесями цитратной крови. Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же разными концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, в том же количестве, как и физраствора.

При этом соотношение средства к взвеси (а также физраствора к взвеси) выбирают из условия: одна часть средства и четыре-шесть частей взвеси.

Выдерживают эти смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки.

За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на дне лунки.

Концентрация взвеси цитратной крови (0,25-0,5%), соотношение вводимого средства к цитратной крови (1:4-6), а также температурный режим (4-8°С), при котором выдерживают смесь в течение 12-15 часов, были подобраны экспериментальным путем.

Так, при концентрации ниже 0,25% и количестве средства для диагностики менее одной части реакция с цитратной кровью практически отсутствовала, а при концентрации выше 0,5% и количестве средства более одной части реакции были не выражены, трудно учитывались.

Температурный режим, при котором происходило взаимодействие средства со взвесями цитратной крови, подбирался также экспериментально. Было апробировано 3 режима: при комнатной температуре (22°С), при 37°С и 4-8°С. При комнатной температуре и при 37°С реакции были плохо выражены, трудно учитывались.

Пример осуществления способа - №2

В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.

Из цитратной крови готовят 0,25%-0,5% взвесь на физиологическом растворе. Ставят реакцию на планшетах с лунками.

Ряды лунок заполняют 0,25%-0,5% взвесями цитратной крови, которые берут в количестве 0,5 мл в каждой лунке: ряд лунок заполняют взвесью 0,25% концентрации, другой - 0,5% концентрации и т.д.

Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в количестве по 0,1 мл в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, также в количестве 0,1 мл.

Соотношение средства к взвеси в данном примере составляет 1:5.

Выдерживают все смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

Результат реакции - положительный (наблюдалось наличие осадка в виде зонтика по всей поверхности лунки).

Аналогично описанному в примере 2 было исследовано еще 50 проб крови животных, из них 32 пробы были положительными, а 18 - отрицательными.

Дополнительно был проведен эксперимент, аналогично описанному в примере 2, но с отмытыми эритроцитами, приготовленными общепринятым методом из цитратной крови животных. Способ проводился при тех же концентрациях и режимах как в примере 2.

Было исследовано также 50 проб. Положительных результатов при использовании отмытых эритроцитов получено не было. Все результаты были отрицательными и не совпадали с общеизвестными методами.

Была произведена сравнительная оценка эффективности заявляемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Исследования проводились в одном из неблагополучных хозяйств на коровах 3-летнего возраста. В эксперимент были отобраны 10 коров, инфицированных вирусом лейкоза КРС, которые одновременно реагировали положительно в РИД, ИФА и ПЦР, и 10 голов животных, не реагирующих одновременно ни в одной из указанных реакций.

Все исследования были выполнены в двукратной повторности с целью подтверждения совпадения результатов исследования и выявления возможных ошибок. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что заявляемый способ позволяет эффективно выявлять инфицированных животных и совпадает с результатами всех общепринятых методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что доказывает специфичность заявляемого средства.

Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу расширения спектра диагностических препаратов в отношении лейкоза крупного рогатого скота. Средство позволяет быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.