СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ СИЛИМАРИНА И НАНОСЕЛЕНА ОКАЗЫВАЮЩЕГО ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к способу получения средства, представляющего собой коллоидный водный раствор наноселена и силимарина, для ингибирования роста опухолевых клеток.

Силимарин - комплекс флавонолигнанов (основных биологически активных веществ расторопши пятнистой Silybum marianum), который включает: силибинин, или силибин (на его долю приходится 60-70%), силикристин (20%), силидианин (10%) и изосилибин (5%).

Накоплено большое количество экспериментальных данных in vitro и in vivo, полученных на экспериментальных моделях рака, которые показывают, что пищевые и лекарственные растения содержат профилактирующие рак соединения. Среди этих агентов растительного происхождения противоопухолевыми являются indole-3-carbinol (13C) и силибинин. 13C является glucobrassicin (C16H19N2O9S2). Эта производная широко представлена в потребляемых овощах семейства крестоцветных, таких как капуста, цветная капуста, брокколи и брюссельская капуста. Он выделяется из крестоцветных овощей под действием мирозиназы - фермента, который присутствует в этих овощах, но выделяется, только когда растительная ткань повреждена при жевании или мацерации (1). 13С ингибирует туморогенез в различных животных моделях, включая рак молочной железы, матки, желудка, толстой кишки, легких и печени, путем модуляции канцерогеном обмена веществ, распространения ингибирования опухолевых клеток, индукции апоптоза, ингибирования ангиогенеза опухоли и инвазии (2-6). В кислой среде желудка 13С подвергается реакции конденсации, способной дать начало нескольким продуктам, преобладающим из которых является 3,3-diindolylmethane (7). 3,3- Diindolylmethane считается ответственным за многие физиологические эффекты 13C в естественных условиях (8).

Силибинин является полифенольным флавоноидом, выделенным из расторопши (Расторопши пятнистой Л. Gaertn) (9). Выявлена противоопухолевая активность силибинина на животных моделях при онкологии кожи, простаты, легких, печени и толстой кишки, через ингибирование клеточного цикла, подавление антиапоптотических генных продуктов, ингибирование клеточных ферментов, воспалительного фактора транскрипции, ангиогенеза и метастазирования (10-12; 23-26).

Силибинин ингибирует несколько цитокин индуцированных сигнальных путей, которые регулируют экспрессию оксид азота синтазы (iNOS) у опухолевой линии клеток А549 и ингибирует их рост в естественных условиях, а также наблюдается снижение системной токсичности доксорубицина в этих исследованиях (13, 14). Диетический силибинин снижает клеточную пролиферацию и ангиогенез путем связывания (iNOS) в уретановой - индуцированной модели рака легких (15). Это также было показано в химиотерапии вызванной уретаном аденокарциномы легких, где силибинин также ингибирует ангиогенез (16). Силибинин также уменьшает распространение человеческого non-small cell lung carcinoma (NSCLC) H1299, H460 и H322 клетки по ориентации клеточного цикла (17).

Антиангиогенная эффективность силибинина может быть опосредована через ингибирование оксида азота (NO), который играет важную роль при ангиогенезе опухоли. NO является свободным радикалом, который регулирует разнообразные физиологические и патологические процессы (18). NO синтезируется в трех основных изоформах из NO-синтазы (iNOS), клеток эндотелия (eNOS), нейронов (nNOS) NOS и индуцируемой NOS (iNOS). Из этих изоферментов iNOS производит наибольшее количество NO (19). Большая активность iNOS наблюдается в опухолях легких, чем в окружающих нормальных тканей, и уровни также iNOS повышаются в альвеолярных и опухолеассоциированных макрофагов, легочном эндотелии, эпителии дыхательных путей (20). Экспресия iNOS/ активность коррелирует с ангиогенным статусом и метастатическим потенциалом в широком диапазоне опухолей. iNOS ингибирование природными и синтетическими соединениями был эффективным при исследовании химиопрофилактики рака (21, 22).

Известно использование селена в качестве терапевтического средства, т.е. препарата, способного участвовать в окислительно-восстановительных процессах клеток организма (см., например, патенты РФ №2394583, №2426444, сайты http://fitoapteka.com/read/ru; http://www.naturoprof.ru. http://bezvreda.com/selen-v-pitanii/). Селен нормализует обмен протеинов и нуклеиновых кислот; регулирует специфический и неспецифический иммунитет за счет активизации функции нейтрофилов, пролифирации Т-, В-лимфоцитов, генерирование продукции антител, лимфокинов; улучшает адаптацию организма; уменьшает токсичное влияние веществ, солей тяжелых металлов, лекарств, других различных антибиотиков; предотвращает развитие окислительного процесса, свободнорадикальных болезней, в том числе атеросклероза и его осложнений, некрозов печени, панкреатитов, рассеянного склероза, паркинсонизма, других заболеваний.

Общепризнано, что микроэлемент селен (Se) - необходимый нутриент для нормального функционирования организма человека и животных, так как он входит в состав большинства гормонов и ферментов, активно участвуя в обмене веществ. Он выполняет в организме каталитическую, структурную и регуляторную функции; взаимодействует с витаминами, ферментами и биологическими мембранами; участвует в окислительно-восстановительных процессах, клеточном дыхании, обмене жиров, белков и углеводов. Роль селена в организме во многом определяется его включением в состав одного из важнейших ферментов - глутатионпероксидазы, защищающей клетки от продуктов перекисного окисления. Таким образом, селен и его соединения проявляют значительную антиоксидантную активность. Данный элемент входит в состав и других ферментов, участвует в детоксикации ксенобиотиков, регулирует функции щитовидной и поджелудочной желез, проявляет гепатозащитный эффект, стимулирует антитоксическую защиту организма, положительно влияет на систему репродукции, обладает радиопротекторным действием.

Однако применение средства на основе коллоидного селена и силимарина, полученного предложенным способом, в качестве средства, эффективно ингибирующего рост опухолевых клеток, до настоящего времени неизвестно.

Задача изобретения заключается в получении эффективного средства, обладающего ингибирующим действием на рост опухолевых клеток.

Технический результат заключается в получении средства предложенным способом, которое обладает высоким ингибирующим действием на рост опухолевых клеток.

Технический результат достигается путем предложенного способа получения средства, включающего приготовление смеси (1) путем внесения 250 мкл 0,5М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл полиэтиленгликоля 400 (далее ПЭГ 400), интенсивного перемешивания на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55, далее готовят смесь (2) путем внесения 250 мкл 0,5 М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 0,68, при интенсивном перемешивании вносится в смесь (1) смесь (2) по каплям, удаляют ПЭГ 400 и солянокислый гидразин диализом полученной смеси против дистиллированной воды, избыток воды отгоняют на роторном испарителе, к полученному раствору вносится предварительно растворенный в солюфоре силимарин, солюфор удаляется диализом, доводят pH до 7,2-7,4, при этом компоненты смешивают в количестве, обеспечивающем содержание их в средстве, в мас.%:

Преимущество средства, полученного предложенным способом, заключается в том, что с помощью наночастиц на основе селена силимарин доставляется в клетку. При этом биодинамика силимарина, соединенного с коллоидным селеном, происходит лимфогенным путем и в меньшей степени подвергается ферментной деградации и нейтрализации печенью. Происходит действие силимарина и селена в отношении ингибирования роста опухолевых клеток.

Также определенным преимуществом служит то, что сам селен является частью метаболической цепочки организма и способен усваиваться во внутриклеточном пространстве. Тем самым устраняются нежелательные последствия, связанные с «утилизацией» организмом самого носителя.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Доведение pH до 7,2-7,4 обусловлено необходимостью создания стабильной системы, поскольку значения кислотности выше или ниже указанных пределов приведет к разрушению коллоидного раствора.

Выбор условий технологических стадий при осуществлении способа обусловлен необходимостью соответствия решаемой задачи. Значения концентраций компонентов обеспечивает однородность и стабильность полученного средства.

Пример 1

- Готовят смесь селенистой кислоты с ПЭГ 400 (смесь 1) путем внесения 250 мкл 0,5 М водного раствора селенистой кислоты в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, pH данной смеси - 7,55.

- Готовят смесь солянокислого гидразина с ПЭГ 400(смесь 2) путем внесения 250 мкл 0,5 М водного раствора солянокислого гидразина в 8 мл ПЭГ 400, интенсивно перемешивают на магнитной мешалке при не менее 750 об/мин, рН данной смеси - 0,68.

- При интенсивном перемешивании вносится в смесь (1) смесь (2) по каплям. Полученный раствор ставят на диализ против дистиллированной воды, при этом из раствора удаляется ПЭГ 400 и солянокислый гидразин.

- Отгоняют избыток воды (в количестве, равном объему далее вносимого силимарина).

- К полученному раствору вносится предварительно растворенный в солюфоре силимарин до конечной концентрации 1,7%, солюфор удаляют с помощью диализа.

- Доводят pH до 7,2-7,4.

Итого в данном средстве получаем:

В процентном соотношении от общего объема состав средства будет следующим, в мас.%:

Средство, полученное предложенным способом, представляет собой прозрачный раствор, цвет которого варьируется от кирпично-красного до оранжевого. Средство хранят при температуре от +2 до +20°C в темном месте.

Средство, полученное предложенным способом, представляет собой коллоидный раствор наночастиц селена с адсорбированными на его поверхности частицами силимарина.

Наночастицы в препарате выявляли методом электронной микроскопии. На рисунке 1 приведен снимок средства на основе коллоидного селена с силимарином. На рисунке 1 видны наночастицы с размером от 40 до 100 нм.

Концентрацию силимарина в средстве определяли хроматографически. На рисунке 2 приведена хроматограмма образца силимарина. Установлено, что концентрация силимарина в образцах соответствовала внесенной.

Пример 2

Биологические исследования средства на основе селена с силимарином, полученного по примеру 1

Использованные в работе культуры клеток почек эмбрионов свиньи, несущие онковирусы А и С, (SPEV-2) и человеческих раковых клеток HeLa, фибробласты хомячка получены из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии научно-исследовательской ветеринарной станции Российской академии наук (г. Саратов). Культивирование клеточных культур проводили в пластиковых флаконах в полной RPMI среде (10%) эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин) при 37°C. Диссоциация клеток монослойной культуры достигалась промыванием монослоя раствором трипсина в течение 10 мин.

Исследования на животных проводили с использованием перевиваемой линии рака почки РА крыс. Опухоль перед введением размельчали в растворе Хенкса с 0,001% трипсина до единичных клеток. Суспензию центрифугировали при 450g 15 минут. Онкологические клетки из надосадочной жидкости вводили подкожно между лопаток. Через 2 недели наблюдали образование подкожной опухоли.

Доза силимарина, вводимая крысам внутрибрюшинно, - 100 мкг/кг. Препарат вводился три раза в день в течение 30 дней. Доза селена 3,6 мкг/кг.

Для выполнения поставленных задач использовали 4 группы животных (крысы) по 5 голов в каждой. Общая схема опыта представлена в таблице 1.

При изучении возможности использования селеновых сферических наночастиц для внутриклеточной доставки силимарина определяли оптимальное количество клеток. Подсчет клеток осуществлялся с помощью камеры Горяева.

МТТ-тест проводили по следующей методике: чистую культуру клеток и клетки с добавлением препаратов инкубировали по 500 мкл в пробирках эппендорф при 37°C в течение 48 часов. Каждую пробирку с клеточными суспензиями по окончании инкубирования центрифугировали 10 мин при 1000 g. Перерастворяли полученный осадок в 500 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение часа. После инкубации клетки перерастворяли в 500 мкл ДМСО, отбирали по 200 мкл суспензии из каждой пробирки и помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Показания оптической плотности считывали на ридере.

Изучение биологических свойств соединения коллоидного селена с силимарином проводили на клеточных линиях HeLa.

При проведении инкубирования клеток HeLa на обедненной и обогащенной средах в течение семи суток было определено, что в обоих случаях их количество приблизительно одинаково (5×10⁴ шт/мл), показатели интенсивности дыхания примерно равны, что говорит об отсутствии влияния состава питательной среды на свойства популяции клеток при малой экспозиции.

В данном случае за 100% дыхательной активности клеток нами была взята величина оптической плотности образца с максимальным количеством клеточного материала, при измерении на биохимическом анализаторе на длине волны 492 нм.

Концентрация введенных активных веществ:

1. Коллоидный селен с силимарином - 0,001М силимарин.

2. Коллоидный селен - 0,001М селен.

В клеточную популяцию вводилось силимарина 1 нг/мл; селена 5 нг/мл.

МТТ-тест. Исследуемые точки: селен силимарин; селен; контроль.

Проверка цитостатической активности раствора силимарина с селеном проводилась с использованием клеточной линии HeLa (см. рисунок 3).

При проведении исследования было обнаружено, что селен снижает дыхательную активность клеток на 47%, средство, полученное предложенным способом, на основе силимарина с селеном - на 68%, а силимарин - на 40% (в качестве контроля использовали раствор селена в полной RPMI среде).

Селен с силимарином поглощается клетками HeLa при концентрации препарата примерно 2 мг/мл.

Влияние средства, полученного предложенным способом, на торможение развития опухоли проводили с использованием перевиваемой опухоли крысиной линии рака почки РА.

Средство вводилось трехкратно с интервалом в 7 дней, после этого животных подвергали эвтаназии и проводили взвешивание опухоли и изменение ее объема. Данные представлены в таблице 2

Степень торможения опухоли вычисляется по формуле:

TPO%=(Vконтроля - Vопыта)/Vконтроля×100

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: селен тормозит развитие опухоли на 54%, силимарин - на 60%, а средство, полученное предложенным способом, на основе селена с силимарином - на 91%.

Средство, полученное предложенным способом, обладает повышенным ингибирующим действием на рост опухолевых клеток.

Параллельно нами проводилось исследование на нормальных не онкологических клетках. В качестве клеток использовали клеточную линию из фибробластов хомячка.

При проведении исследования было обнаружено, что селен повышает дыхательную активность нормальных клеток на 34%, силимарин с селеном - на 16%, а силимарин на здоровые клетки не влияет (см. рисунок 4). В качестве контроля использовали раствор селена в полной RPMI среде.

Список литературы

1. Vang, O. et al. (1996) Naturally Occurring Antimutagens. III. Indoles. Nordic Council of Ministers, Copenhagen, Denmark.

2. International Agency for Research on Cancer. (2004) Cruciferous Vegetables, Isothiocyanates, and Indoles. IARC Handbooks of Cancer Prevention., Vol. 9, IARC, Lyon, pp. 171-176.

3. Rahman, K.M. et al. (2000) Translocation of Bax to mitochondria induces apoptotic cell death in indole-3-carbinol (I3C) treated breast cancer cells. Oncogene, 19, 5764-5771.

4. Rahman, K.M. et al. (2004) Inactivation of akt and NF-kappaB play important roles during indole-3-carbinol-induced apoptosis in breast cancer cells. Nutr. Cancer, 48, 84-94.

5. Rahman, K.M. et al. (2006) Therapeutic intervention of experimental breast cancer bone metastasis by indole-3-carbinol in SCID-human mouse model. Mol. Cancer Ther., 5, 2747-2756.

6. Aggarwal, B.B. et al. (2005) Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4, 1201-1215.

7. Anderton, M.J. et al. (2004) Pharmacokinetics and tissue disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice. Clin. Cancer Res., 10, 5233-5241.

8. Bjeldanes, L.F. et al. (1991) Aromatic hydrocarbon responsiveness-receptor agonists generated from indole-3-carbinol in vitro and in vivo: comparisons with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 9543-9547.

9. Wellington, K. et al. (2001) Silymarin: a review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs, 15, 465-489.

10. Agarwal, R. et al. (2006) Anticancer potential of silymarin: from bench to bed side. Anticancer Res., 26, 4457-4498.

11. Singh, R.P. et al. (2006) Effect of silibinin on the growth and progression of primary lung tumors in mice. J. Natl Cancer Inst., 98, 846-855.

12. Agarwal, C. et al. (2003) Silibinin upregulates the expression of cyclindependent kinase inhibitors and causes cell cycle arrest and apoptosis in human colon carcinoma HT-29 cells. Oncogene, 22, 8271-8282.

13. Chittezhath M, Deep G, Singh RP, Agarwal C, Agarwal R. Silibinin inhibits cytokine-induced signaling cascades and down-regulates inducible nitric oxide synthase in human lung carcinoma A549 cells. Mol Cancer Ther. 2008; 7:1817-1826. [PubMed: 18644994].

14. Singh RP, Mallikarjuna GU, Sharma G, et al. Oral silibinin inhibits lung tumor growth in athymic nude mice and forms a novel chemocombination with doxorubicin targeting nuclear factor kappaB-mediated inducible chemoresistance. Clin Cancer Res. 2004; 10:8641-8647. [PubMed: 15623648].

15. Singh RP, Deep G, Chittezhath M, et al. Effect of silibinin on the growth and progression of primary lung tumors in mice. J Natl Cancer Inst. 2006; 98:846-855. [PubMed: 16788158].

16. Tyagi A, Singh RP, Ramasamy K, et al. Growth inhibition and regression of lung tumors by silibinin: modulation of angiogenesis by macrophage-associated cytokines and nuclear factorkappaB and signal transducers and activators of transcription 3. Cancer Prev Res (Phila Pa). 2009; 2:74-83.

17. Mateen S, Tyagi A, Agarwal C, Singh RP, Agarwal R. Silibinin inhibits human nonsmall cell lung cancer cell growth through cell-cycle arrest by modulating expression and function of key cell cycle regulators. Mol Carcinog. 2010; 49:247-258. [PubMed: 19908243].

18. Fujimoto H, Ando Y, Yamashita T, et al. Nitric oxide synthase activity in human lung cancer. Jpn J Cancer Res. 1997; 88:1190-1198. [PubMed: 9473737].

19. Murakami A. Chemoprevention with phytochemicals targeting inducible nitric oxide synthase. Forum Nutr. 2009; 61:193-203. [PubMed: 19367123].

20. Liu CY, Wang CH, Chen TC, Lin HC, Yu CT, Kuo HP. Increased level of exhaled nitric oxide and up-regulation of inducible nitric oxide synthase in patients with primary lung cancer. Br J Cancer. 1998; 78:534-541. [PubMed: 9716040].

21. Murakami A. Chemoprevention with phytochemicals targeting inducible nitric oxide synthase. Nitric Oxide. 2008; 19:217-224. [PubMed: 18515106].

22. Fitzpatrick B, Mehibel M, Cowen RL, Stratford IJ. iNOS as a therapeutic target for treatment of human tumors. Forum Nutr. 2009; 61:193-203. [PubMed: 19367123].

23. Kauntz H, Bousserouel S, Gosse F, Marescaux J, Raul F. (2012) Silibinin, a natural flavonoid, modulates the early expression of chemoprevention biomarkers in a preclinical model of colon carcinogenesis. Int J Oncol 41(3): 849-854.

24. Deep G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, Gu M, et al. (2012) Angiopreventive efficacy of pure flavonolignans from milk thistle extract against prostate cancer: targeting VEGF-VEGFR signaling. PLoS One 7(4): e34630.

25. Deep G, Agarwal R (2010) Antimetastatic efficacy of silibinin: molecular mechanisms and therapeutic potential against cancer. Cancer Metastasis Rev 29(3): 447-463.

26. Raina К, Agarwal С, Agarwal R (2013) Effect of silibinin in human colorectal cancer cells: targeting the activation of NF-kB signaling. Mol Carcinog 52(3): 195-206.