СОСТАВЫ АНТИТЕЛА

2

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к стабильным составам антитела. Предпочтительные стабильные составы содержат: 25-250 мг/мл антитела, от 10 до 30 мМ буферных соединений, от 1 до 15% полиола, от 0,001% до 0,05% поверхностно-активного вещества и pH от 5 до 7,5. Дополнительный аспект изобретения относится к способу получения указанных выше составов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Моноклональные антитела (mAb) позволяют охарактеризовывать физиологически важные молекулы, экспрессирующиеся на поверхности клетки. Их определяют в клетках иммунной системы как "кластеры дифференцировки лейкоцитов" или антигены (CD) (Scholossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15 (3);98). Определение роли CD в дифференцировке и созревании лимфоидных клеток в течение их онтогенетического развития, в механизмах клеточного распознавания и адгезии и в механизмах активации и пролиферации в течение иммунного ответа с многообещающими результатами проводили для применения соответствующих им mAb в диагностике и иммунотерапии (Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740).

Последние достижения в развитии биотехнологий представили широкий спектр биологически активных полипептидов в достаточно больших количествах для применения в качестве лекарственных средств. Однако полипептиды могут терять свою потенциальную биологическую активность в результате физической нестабильности, включая денатурацию и образование растворимых и нерастворимых агрегатов, и химической нестабильности, такой как гидролиз, окисление и дезамидирование. На стабильность полипептидов в жидких фармацевтических составах могут влиять факторы, например, такие как pH, ионная сила, температура, повторяемые циклы замораживания-размораживания и воздействие механической силы сдвига, такой, которая возникает при обработке. Агрегация и потеря биологической активности также могут происходить в результате физического встряхивания и взаимодействия молекул полипептида в растворе и на поверхности раздела фаз жидкость-воздух в сосудах для хранения.

US20030190316 относится к стабилизирующим препаратам, содержащим антитело в глициновом буфере и/или гистидиновом буфере, а также относится к способам получения содержащего белок стабилизированного препарата, включающим доведение pH основной аминокислотой, или производным основной аминокислоты или ее солью.

В то время как составляли ряд жидких фармацевтических композиций для стабилизации биологической активности содержащихся в них полипептидов, деградация полипептидов в жидких составах продолжает создавать проблемы для врачей-терапевтов. Таким образом, существует необходимость дополнительных фармацевтических композиций, содержащих физиологически совместимые стабилизаторы, повышающие стабильность полипептидных компонентов, таким образом, поддерживающие их терапевтическую эффективность.

ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Основной целью настоящего изобретения является получение состава, содержащего антитело, буфер и фармацевтически приемлемый эксципиент(ы).

Другой целью настоящего изобретения является получение состава, содержащего антитело или его фрагменты, буфер и лиопротекторы.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение стабильных составов антитела.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к гистидин-трегалозному составу, содержащему: антитело T1h, гистидиновый буфер, сахар трегалозу и фармацевтически приемлемый эксципиент(ы), где гистидин-трегалозный состав снижает HMWP приблизительно на 20%; гистидин-трегалозный состав антитела, содержащий: a) от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5; гистидин-трегалозный состав антитела, содержащий: a) от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5; c) от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,05% неионного поверхностно-активного вещества; и гистидин-трегалозный состав антитела, содержащий: a) от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5; c) от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,05% неионного поверхностно-активного вещества; и d) лиопротектор и/или криопротектор.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Нестабильность pH в течение периода исследования в различных оцениваемых составах.

Фигура 2: Значения осмоляльности в течение периода исследования в различных оцениваемых составах.

Фигура 3: Нормализованный график флуоресценции, на котором, показано, что спектр и длина волны при максимальном поглощении для образцов в различных составах, инкубированных в различных условиях, не отличаются.

Фигура 4: Анализ гидродинамического радиуса образцов.

Фигура 5: Распределение вариантов зарядов в образцах, инкубированных при 40°C.

Фигура 6: Распределение вариантов зарядов в образцах, инкубированных при 40°C (выделены гистидин-трегалоза).

Фигура 7: Наложение профилей ионообменной хроматографии для составов на основе фосфата и гистидина, демонстрирующее большее содержание кислых вариантов в составах на основе фосфата.

Фигура 8: На фигуре представлено снижение % мономеров в образцах, инкубированных при 40°C.

Фигура 9: На фигуре показано повышение деградантов по результатам SEC (%HMWP + %LMWP) при 40°C.

Фигура 10: Повышение LMWP в четырех тестируемых составах. Все четыре состава демонстрируют одну и ту же тенденцию, и значения очень схожи, за исключением гистидин-трегалозного состава, обладающего крайне низкой фрагментацией по сравнению с другими.

Фигура 11: Тенденция повышения HMWP в четырех тестируемых составах. Содержащие гистидин составы демонстрировали более низкую агрегацию по сравнению с фосфатными образцами.

Фигура 12: Нестабильность pH образцов T1h в различных составах.

Фигура 13: Концентрация белка в образцах, подвергнутых повторному замораживанию-размораживанию.

Фигура 14: Профили SEC для образцов 1 мл в фосфате и гистидине после повторного замораживания-размораживания.

Фигура 15: Сравнение профилей SEC образцов 0,5 мл в фосфатных и гистидиновых составах.

Фигура 16: Данные SEC для образцов 1 мл в обоих составах, подвергнутых повторному замораживанию-размораживанию.

Фигура 17: Данные SEC для образцов 0,5 мл в обоих составах, подвергнутых повторному замораживанию-размораживанию.

Фигура 18: Наложение профилей ионообменной хроматографии образцов 1 мл, демонстрирующих возможное элюирование агрегатов в фосфатных образцах через 40 мин.

Фигура 19: Наложение профилей образцов 0,5 мл, демонстрирующих элюирование агрегатов в фосфатных образцах через 40 мин, но не в гистидиновых образцах.

Фигура 20: Данные IEX для образцов 1 мл, подвергнутых повторному замораживанию-размораживанию в фосфатных и гистидиновых составах.

Фигура 21: Данные IEX для образцов 0,5 мл, подвергнутых повторному замораживанию-размораживанию в фосфатных и гистидиновых составах.

Фигура 22: Нестабильность pH в замороженных образцах.

Фигура 23: Концентрация белка в замороженных образцах для исследования стабильности.

Фигура 24: Наложения SEC для исследования стабильности в замороженном состоянии, демонстрирующих незначительное повышение агрегации в фосфатных образцах.

Фигура 25: Данные SEC распределения вариантов размера замороженных образцов для исследования стабильности.

Фигура 26: Наложения хроматограмм IEX замороженных образцов для исследования стабильности.

Фигура 27: Данные IEX для исследования стабильности в замороженном состоянии в фосфатных и гистидиновых образцах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к гистидин-трегалозным составам, содержащим антитело T1h, гистидиновый буфер, сахар трегалозу и фармацевтически приемлемый эксципиент(ы), где гистидин-трегалозный состав снижает HMWP приблизительно на 20%.

Настоящее изобретение также относится к гистидин-трегалозному составу, где фармацевтически приемлемый эксципиент(ы) выбран из криопротектора, лиопротектора, поверхностно-активного вещества и наполнителя, или любого их сочетания.

В варианте осуществления настоящего изобретения, где гистидин-трегалозный состав снижает HMWP приблизительно на 20% по сравнению с фосфат-сахарозным составом, повышающим HMWP приблизительно на 90%, фосфат-трегалозным составом, повышающим HMWP приблизительно на 90%, и гистидин-сахарозным составов, снижающим HMWP приблизительно на 11%.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения поверхностно-активные вещества выбраны из группы, содержащей полисорбат 20 и полисорбат 80.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения наполнители выбраны из группы, содержащей глицин и маннит.

Настоящее изобретение дополнительно относится к гистидин-трегалозному составу антитела, содержащему: a) от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5.

Настоящее изобретение дополнительно относится к гистидин-трегалозному составу антитела, содержащему: a) от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5; и c) от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,05% неионного поверхностно-активного вещества. Настоящее изобретение также относится к гистидин-трегалозному составу антитела, содержащему: a) от приблизительно 100 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл антитела T1h; b) гистидиновый буфер, обеспечивающий pH от 5 до 7,5; c) от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,05% неионного поверхностно-активного вещества; и d) лиопротектор и/или криопротектор.

В варианте осуществления настоящего изобретения состав является лиофилизированной таблеткой или порошком.

В варианте осуществления настоящего изобретения состав дополнительно перерастворяют в стерильной воде для инъекций или бактериолитической воде для инъекций.

Основной целью изобретения является предоставление стабильной жидкой фармацевтической композиции, содержащей: антитело, буферные вещества, полиол и поверхностно-активное вещество. Обнаруживали, что выгодным является то, что состав композиции по настоящему изобретению приводит к композиции, стабильной после хранения. "Стабильная после хранения" будет означать, что иммуноглобулин, по существу, ни образует агрегаты, ни деградирует, и сохраняет приемлемые уровни активности in vitro и in vivo.

Другой аспект изобретения относится к способу получения состава антитела.

Настоящее изобретение относится к жидким фармацевтическим композициям, содержащим антитело в качестве терапевтически активного компонента, и способам, применимым для их получения. В целях настоящего изобретения термин "жидкие" в отношении фармацевтических композиций или составов предназначен для включения термина "водный". Как применяют в настоящем документе, термин "антитело" включает природные (нативные), синтетические и рекомбинантные антитело и белки, и их биологически активные варианты. Термин "терапевтически активный компонент" предназначен для обозначения антитела, специально включенного в композиции для получения желаемого терапевтического ответа в отношении лечения, предотвращения или диагностики заболевания или состояния индивидуума при введении индивидууму фармацевтической композиции.

Более конкретно, композиции по изобретению являются стабилизированными жидкими фармацевтическими композициями, терапевтически активные компоненты которых включают антитело, в норме демонстрирующее агрегацию при хранении в жидких фармацевтических составах. Термин "агрегация" предназначен для обозначения физического взаимодействия между молекулами полипептида, приводящего к образованию олигомеров, которые могут оставаться растворимыми, или больших видимых агрегатов, осаждающихся из раствора. Термин "при хранении" предназначен для обозначения того, что однажды полученную жидкую фармацевтическую композицию или состав не вводят индивидууму немедленно. Предпочтительнее, после получения его упаковывают для хранения в жидкой форме, в замороженном состоянии или в сухой форме для последующего перерастворения в жидкую форму или другую форму, подходящую для введения индивидууму. Образование полипептидом агрегатов при хранении жидкой фармацевтической композиции может отрицательно влиять на биологическую активность данного полипептида, приводя к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, агрегация может вызывать другие проблемы, такие как блокирование системы для внутривенных вливаний, мембран или насосов, если содержащую полипептид фармацевтическую композицию вводят с применением системы для вливаний.

Стабилизированные жидкие фармацевтические композиции по изобретению дополнительно содержат буферные вещества. Данные буферные вещества, в основном, включают фосфат или гистидин. Буферные вещества состава предназначены для поддержания pH. pH фосфатных составов устанавливали на 7 и pH гистидинового состава устанавливали на 6, т.к. данные pH попадают в буферный диапазон данных буферных веществ.

Стабилизирующее количество поверхностно-активного вещества, добавляемое в композицию по изобретению, является количеством, достаточным для ингибирования агрегации или помутнения в содержащих антитело композициях. Такая агрегация может происходить, например, после длительного хранения, механического взбалтывания, замораживания и размораживания. Наблюдают значимое ингибирование агрегации или помутнения, и помутнение/агрегация составляет, по меньшей мере, на 10% меньше в содержащей антитело композиции с поверхностно-активным веществом, чем в сравниваемом составе, не содержащем поверхностно-активное вещество, предпочтительно - по меньшей мере, на 50% меньше, более предпочтительно - по меньшей мере, на 70% меньше, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, на 90% меньше. Необходимо осуществлять визуальный осмотр сосудов и содержащей антитело композиции с измерением поглощения при 320 нм для определения способности полисорбата 80 поддерживать молекулы белка в растворе. Поглощение при 320 нм, возникающее в основном в результате рассеяния молекул в растворе, являлось гораздо более выраженным в образцах без полисорбата 80.

Как применяют в настоящем документе, термин "поверхностно-активное вещество" предназначен для включения любого детергента, обладающего гидрофильной областью и гидрофобной областью, и он включает неионные, катионные, анионные и цвиттерионные детергенты. Подходящие поверхностно-активные вещества включают, например, полиоксиэтилен сорбитанмоноолеат (также известный как полисорбат 80 или Tween-80), полиоксиэтилен сорбитанмонолаурат (также известный как полисорбат 20 или Tween-20) или N-лаурилсаркозин. Неионное поверхностно-активное средство является предпочтительным для составов, описываемых в настоящем документе. Такие неионные поверхностно-активные средства можно выбирать их следующих поверхностно-активных веществ, таких как полоксамер или сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, например, полисорбат 20 или полисорбат 80. Полисорбат 80 является предпочтительным для композиций по данному изобретению. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации 0,01-0,5% по массе.

Каждый из полипептидов субъединиц иммуноглобулинов содержит константную область и вариабельную область. В большинстве молекул вариабельная область тяжелой цепи, или VH домен, и вариабельная область легкой цепи, или VL домен, соединяются с образованием антигенсвязывающего домена, состоящего из "определяющих комплементарность областей" или CDR, части молекулы иммуноглобулина, специфически входящей в антигенсвязывающий участок для конкретного эпитопа. Как правило, каждая из тяжелых и легких цепей имеет три CDR, соединяющихся с образованием антигенсвязывающего участка иммуноглобулина. Как правило, но не всегда, "антигенсвязывающий домен" молекулы иммуноглобулина состоит, по меньшей мере, из части вариабельного домена одной тяжелой цепи и, по меньшей мере, части вариабельного домена одной легкой цепи, соединенных дисульфидными связями. Fc-область необходима для выполнения эффекторных функций антител. Эффекторные функции включают инициацию комплементзависимой цитотоксичности (CDC), инициацию фагоцитоза и антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и перенос антител через клеточные барьеры посредством трансцитоза. Кроме того, Fc-область критична для поддержания времени полужизни антитела класса IgG в сыворотке (Ward и Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к измененному антителу или функциональному фрагменту, выбранному из Fab, Fc или его части.

В дополнительном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

Композиция может включать одно или несколько буферных веществ, один или несколько полиолов и одно или несколько поверхностно-активных веществ.

Композиция включает фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтически приемлемые носители включают, в качестве неограничивающих примеров, физиологический раствор, стерильную воду, фосфатно-солевой буфер и т.п. В композиции по настоящему изобретению можно включать другие буферные средства, диспергирующие средства и инертные нетоксические вещества, подходящие для доставки лекарственного средства пациенту. Композиции могут являться растворами, подходящими для введения, и, как правило, являются стерильными и не содержат нежелательные твердые частицы.

Буферы, применяемые в контексте настоящего изобретения, предпочтительно, являются фосфатными или гистидиновыми. Наиболее предпочтительно, буферы, применяемые в составах по настоящему изобретению, не ограничены ацетатами, сукцинатами, гистидином и фосфатами, которые можно применять в качестве буферов или в сочетании.

Желательно, pH раствора состава находится в диапазоне от 5 до 7,5, и pH раствора, предпочтительно, находится в диапазоне от 5,5 до 6 с доведением конечного pH до желаемого уровня, если необходимо.

Полиолы, применяемые в контексте настоящего изобретения, являются восстанавливающими сахарами, выполняющими несколько функций, например, стабилизатора антитела, также в состав включают модификатор тоничности, и криопротектор и лиопротектор. Наиболее предпочтительно, полиолы, применяемые в составе по настоящему изобретению, являются невосстанавливающими сахарами, такими как сахароза или трегалоза.

Другие фармацевтически приемлемые эксципиенты, хорошо известные специалистам в данной области, могут также составлять часть заявляемых композиций. Они включают, например, различные наполнители, и где наполнитель выбран из глицина или маннита.

В одном из вариантов осуществления сахарный компонент состава (сахароза и трегалоза) выполняет разностороннюю функцию: сахара действуют как стабилизатор антитела, защищая его от деградации; они являются крио/лиопротекторами, защищающими антитело при лиофилизации (включающей и замораживание, и размораживание); они также являются модификаторами тоничности, концентрацию которых можно регулировать для получения изотоничного препарата. Тоничность важна для подкожно вводимого препарата, такого как этот, т.к. изотоничный препарат способен значимо снижать жжение в месте инъекции. Для оценки выбирали сахарозу и трегалозу, т.к. оба сахара являются невосстанавливающими, и их широко применяют для стабилизации белков. Концентрацию сахара выбирали для получения изотоничного раствора для подкожного введения.

В другом варианте осуществления изобретения результаты скринингового исследования свидетельствуют о том, что при 2-8°C и подвергании замораживанию/размораживанию не наблюдали значимых различий HMWP или LMWP между составами. Однако при инкубации при 40°C физическая стабильность антитела улучшалась в содержащих гистидин буферах по сравнению с составами на основе фосфатов, особенно в отношении агрегации (фигура 11). Образец T1h в гистидин-трегалозном составе неизменно проявлял наивысшую процентную долю мономеров и, таким образом, наименьшую процентную долю деградантов во всех тестируемых составах.

В еще одном варианте осуществления изобретения распределение вариантов зарядов не изменялось при инкубации антитела при 2-8°C или при замораживании/размораживании. Однако при инкубации антитела при 40°C выявляли различия в степени стабилизации, обеспечиваемой каждым составом. В составах на основе гистидина медленнее накапливались кислые варианты по сравнению с фосфатными составами. Среди гистидиновых составов гистидин-трегалозные составы постоянно демонстрировали меньшее содержание кислых вариантов и, таким образом, больший % основного пика по сравнению с гистидин-сахарозным составом (Фигура 5: Распределение вариантов зарядов в образцах, инкубированных при 40°C. Фигура 6: Распределение вариантов зарядов в образцах, инкубированных при 40°C). Активность/биологическая активность антитела не изменялась в любом составе и/или состоянии и сравнима со стандартом. Данный вывод можно сделать потому, что анализ активности (activity)/активности (potency) до сих пор не разработан в достаточной для дискриминации различных составов степени. Это может являться важным аспектом для рассмотрения в свете того, что составы на основе гистидина способны защищать антитело от деградации лучше, чем фосфатный состав.

В другом варианте осуществления изобретения конформационная стабильность антитела по результатам флуоресцентной спектроскопии и DSC не претерпела значительных изменений в любых тестируемых составах. Не выявляли изменения длины волны при максимальном поглощении (которые могут указывать на изменения в 3D-конформации антитела) в эксперименте с флуоресценцией (фигура 3). Аналогично, не наблюдали значимых различий в температурах плавления, наблюдаемых для T0-образцов и образцов при 40°C, что свидетельствует о том, что различные домены антитела все еще не свернуты так же, как и в начале исследования.

Настоящее изобретение дополнительно описывают в следующих примерах. Следует понимать, что данные примеры, демонстрирующие предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены исключительно в иллюстративных целях. Из приведенного выше описания и данных примеров специалист в данной области может определять основные характеристики данного изобретения и без отступления от сущности и объема изобретения может осуществлять различные изменения и модификации изобретения для его адаптации для различного применения и состояний.

Изобретение будет более понятным из следующих примеров. Однако специалистам в данной области будет понятно, что данные примеры приведены исключительно в целях иллюстрирования изобретения, определенного приведенной ниже формулой изобретения.

Настоящее изобретение также дополнено следующими примерами и фигурами. Однако данные примеры не предназначены для ограничения объема изобретения.

Следующие примеры представляют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

A. Состав, содержащий mAB, можно получать следующими способами.

Очищенное антитело концентрируют с применением тангенциальной поточной фильтрации (TFF) или UF/DF до требуемой высокой концентрации и затем буфер заменяют на буфер состава.

Очищенное антитело концентрируют до концентрации от 20 до 30 мг/мл с применением тангенциальной поточной фильтрации (TFF) или UF/DF и затем буфер заменяют на буфер состава. Затем данный образец подвергают лиофилизации, и однажды лиофилизированную таблетку перерастворяют в подходящем объеме WFI для достижения требуемой конечной концентрации препарата лекарственного средства.

Совокупность лекарственного вещества лиофилизируют и затем растворяют в буфере состава до требуемой концентрации.

Антитело концентрируют до требуемой высокой концентрации с применением способа хроматографии на колонках, такого как ионообменная хроматография, аффинная хроматография или хроматография с гидрофобным взаимодействием.

B. Химическая стабильность водного состава

Образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, не демонстрировали какую-либо нестабильность при ионообменной хроматографии. Различия в деградации наблюдали только в образцах, инкубированных при 40°C.

С применением ионообменной хроматографии образцов, инкубированных при 40°C, четко демонстрируют меньшее повышение содержания кислых вариантов в гистидиновых составах по сравнению с составами на основе фосфатов. Среди гистидиновых составов содержащий трегалозу состав обладает меньшим содержанием кислых вариантов по сравнению с гистидин-сахарозным составом. Таким образом, гистидин-трегалозный состав является лучшим составом по результатам ионообменной хроматографии.

По результатам SEC образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, демонстрировали небольшое различие или его отсутствие в профиле деградации среди четырех оцениваемых составов.

Однако, образцы, инкубированные при 40°C, демонстрировали различия по скорости снижения содержания мономеров, что, таким образом, влияет на накопление деградантов (HMWP и LMWP), демонстрируя, что в гистидин-трегалозном составе скорость деградации мономеров меньше, в то время как в других трех составах, по-видимому, деградация происходит быстрее. То же самое видно на фигуре для повышения содержания деградантов.

Более тщательное наблюдение повышения HMWP и LMWP показывает, что профиль повышения LMWP следует схожей тенденции во всех составах (фигура), и она состоит в накоплении HMWP, что отличает гистидиновые составы от составов на основе фосфатов - фигура. К концу 5,5 недель состав является содержащим гистидин/трегалозу составом, имеющим наибольший остаток мономеров, а также наименьший % деградантов.

Результаты SEC на фигурах 14-17 свидетельствуют о том, что в образце фосфата/NaCl содержание агрегатов повышалось в течение 4 недель после повторяемого замораживания-размораживания (-80°C), и в течение 4 недель не наблюдали повышения агрегации в His/Tre-составе. Повышение агрегации составляет приблизительно 1,75% в образце объемом 0,5 мл, и 1,41 % в образце объемом 1 мл.

Результаты слабой катионообменной хроматографии на фигурах 18-21 свидетельствуют о том, что распределение вариантов зарядов не изменяется значимо, если в течение четырех недель периода исследования mAb повторно замораживают (-80°C) и размораживают в фосфат/NaCl и гистидин-трегалозном составах.

Однако в образцах фосфата/NaCl повышенные количества белка совместно элюируют с пиком буфера через 40 минут. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 12-13.

Исследование стабильности в замороженном состоянии, представленное на фигурах 24-27, свидетельствует о том, что не наблюдали различий в профиле заряда, но агрегация незначительно повышалась в составе фосфата/NaCl, но не в составе His/Tre. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 22-23.

Пример 2:

A. Состав, содержащий mAB, можно получать следующими способами.

Состав, содержащий антитело T1h, получают способом, схожим с таковым, приведенным в примере 1.

B. Химическая стабильность водного состава

Образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, не демонстрировали какую-либо нестабильность при ионообменной хроматографии. Различия в деградации наблюдали только в образцах, инкубированных при 40°C.

С применением ионообменной хроматографии образцов, инкубированных при 40°C, четко демонстрируют меньшее повышение содержания кислых вариантов в гистидиновых составах по сравнению с составами на основе фосфатов. Среди гистидиновых составов содержащий трегалозу состав обладает меньшим содержанием кислых вариантов по сравнению с гистидин-сахарозным составом. На фигурах 5 и 6 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени процентная доля вариантов заряда повышалась в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 57,48 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 57,46.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами процентная доля варианта заряда была меньше по сравнению с фосфатными составами. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась только от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 49,11 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 32,63 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 45,48.

Таким образом, следует понимать, что гистидин-трегалозный состав является лучшим составом по результатам ионообменной хроматографии.

По результатам SEC образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, демонстрировали небольшое различие или его отсутствие в профиле деградации среди четырех оцениваемых составов.

Однако, образцы, инкубированные при 40°C, демонстрировали различия по скорости снижения содержания мономеров, как показано на фигуре 8, что, таким образом, влияет на накопление деградантов (HMWP и LMWP).

На фигуре 8 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени снижение % мономеров в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозных составов. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, снижение % мономеров в образцах снижалось от 93,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 87,1 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 92,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 87,4.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами снижение % мономеров в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, снижалось только от 91,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 87,9 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 93,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 90,5.

Это свидетельствует о том, что в гистидин-трегалозном составе скорость деградации мономеров меньше, в то время как в других трех составах, по-видимому, деградация происходит быстрее. То же самое видно на фигуре 9 для повышения содержания деградантов.

На фигуре 9 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % деградантов в образцах снижалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, повышение % деградантов в образцах повышалось от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,9 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 7,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,6.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % деградантов в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, повышалось только от 8,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,1 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 6,7 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 9,5.

Как указано и объяснено ниже, более тщательное наблюдение повышения HMWP и LMWP показывает, что профиль повышения LMWP следует схожей тенденции во всех составах (фигура 10), и она состоит в накоплении HMWP, что отличает гистидиновые составы от составов на основе фосфатов (фигура 11). К концу 5,5 недель состав является содержащим гистидин/трегалозу составом, имеющим наибольший остаток мономеров, а также наименьший % деградантов.

На фигуре 10 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % LMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, повышение % LMWP в образцах повышалось от 5,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 9,6 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 5,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 9,6.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % LMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, повышалось только от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 10,7 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 5,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 8,3.

На фигуре 11 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % HMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, повышение % HMWP в образцах повышалось от 2,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,3 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 2,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,0.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % HMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 2 недель, снижалось только от 1,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 1,4 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 1,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 1,2.

Результаты SEC на фигурах 14-17 свидетельствуют о том, что в образце фосфата/NaCl содержание агрегатов повышалось в течение 4 недель после повторяемого замораживания-размораживания (-80°C), и в течение 4 недель не наблюдали повышения агрегации в His/Tre-составе. Повышение агрегации составляет приблизительно 1,75% в образце объемом 0,5 мл, и 1,41 % в образце объемом 1 мл.

На фигуре 16 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 1 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,23 [значение в PBS в T4 - после 4 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров снижался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,72 [значение в His-Tre в T4 - после 4 недель].

На фигуре 17 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 0,5 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 95,87 [значение в PBS в T4 - после 4 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров снижался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,82 [значение в His-Tre в T4 - после 4 недель].

Результаты слабой катионообменной хроматографии на фигурах 18-21 свидетельствуют о том, что распределение вариантов зарядов не изменяется значимо, если в течение четырех недель периода исследования моноклональное антитело T1h повторно замораживают (-80°C) и размораживают в гистидин-трегалозных составах. Однако в образцах фосфата/NaCl повышенные количества белка совместно элюируют с пиком буфера через 40 минут.

С другой стороны, другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 12-13.

Исследование стабильности в замороженном состоянии, представленное на фигурах 24-27, свидетельствуют о том, что не наблюдали различий в профиле заряда, но агрегация незначительно повышалась в составе фосфата/NaCl, но не в составе His/Tre. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 22-23.

Пример 3:

A. Состав, содержащий mAB, можно получать следующими способами.

Состав, содержащий антитело T1h, получают способом, схожим с таковым, приведенным в примере 1.

B. Химическая стабильность водного состава

Образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, не демонстрировали какую-либо нестабильность при ионообменной хроматографии. Различия в деградации наблюдали только в образцах, инкубированных при 40°C.

С применением ионообменной хроматографии образцов, инкубированных при 40°C, четко демонстрируют меньшее повышение содержания кислых вариантов в гистидиновых составах по сравнению с составами на основе фосфатов. Среди гистидиновых составов содержащий трегалозу состав обладает меньшим содержанием кислых вариантов по сравнению с гистидин-сахарозным составом. На фигурах 5 и 6 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени процентная доля вариантов заряда повышалась в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 63,79 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 63,31.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами процентная доля варианта заряда была меньше по сравнению с фосфатными составами. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась только от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 54,02 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 32,63 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 49,59.

Таким образом, следует понимать, что гистидин-трегалозный состав является лучшим составом по результатам ионообменной хроматографии.

По результатам SEC образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, демонстрировали небольшое различие или его отсутствие в профиле деградации среди четырех оцениваемых составов.

Однако, образцы, инкубированные при 40°C, демонстрировали различия по скорости снижения содержания мономеров, как показано на фигуре 8, что, таким образом, влияет на накопление деградантов (HMWP и LMWP).

На фигуре 8 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени снижение % мономеров в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, снижение % мономеров в образцах снижалось от 93,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 87,4 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 92,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 85,0.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами снижение % мономеров в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, снижалось только от 91,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 86,0 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 93,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 89,3.

Это свидетельствует о том, что в гистидин-трегалозном составе скорость деградации мономеров меньше, в то время как в других трех составах, по-видимому, деградация происходит быстрее. То же самое видно на фигуре 9 для повышения содержания деградантов.

На фигуре 9 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % деградантов в образцах снижалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, повышение % деградантов в образцах повышалось от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,6 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 7,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 15,0.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % деградантов в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, повышалось только от 8,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 14,0 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 6,7 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 10,7.

Как указано и объяснено ниже, более тщательное наблюдение повышения HMWP и LMWP показывает, что профиль повышения LMWP следует схожей тенденции во всех составах (фигура 10), и она состоит в накоплении HMWP, что отличает гистидиновые составы от составов на основе фосфатов (фигура 11). К концу 5,5 недель состав является содержащим гистидин/трегалозу составом, имеющим наибольший остаток мономеров, а также наименьший % деградантов.

На фигуре 10 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % LMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, повышение % LMWP в образцах повышалось от 5,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 9,2 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 5,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 11,5.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % LMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, повышалось только от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,5 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 5,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 9,3.

На фигуре 11 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % HMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, повышение % HMWP в образцах повышалось от 2,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,3 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 2,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,5.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % HMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 3 недель, снижалось только от 1,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 1,4 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 1,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 1,5.

Результаты SEC на фигурах 14-17 свидетельствуют о том, что в образце фосфата/NaCl содержание агрегатов повышалось в течение 4 недель после повторяемого замораживания-размораживания (-80°C), и в течение 4 недель не наблюдали повышения агрегации в His/Tre-составе. Повышение агрегации составляет приблизительно 1,75% в образце объемом 0,5 мл, и 1,41 % в образце объемом 1 мл.

На фигуре 16 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 1 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,52 [значение в PBS в T3 - после 3 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров повышался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,89 [значение в His-Tre в T3 - после 3 недель].

На фигуре 17 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 0,5 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,31 [значение в PBS в T3 - после 3 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров повышался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,90 [значение в His-Tre в T3 - после 3 недель].

Результаты слабой катионообменной хроматографии на фигурах 18-21 свидетельствуют о том, что распределение вариантов зарядов не изменяется значимо, если в течение четырех недель периода исследования моноклональное антитело T1h повторно замораживают (-80°C) и размораживают в гистидин-трегалозных составах. Однако в образцах фосфата/NaCl повышенные количества белка совместно элюируют с пиком буфера через 40 минут.

С другой стороны, другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 12-13.

Исследование стабильности в замороженном состоянии, представленное на фигурах 24-27, свидетельствует о том, что не наблюдали различий в профиле заряда, но агрегация незначительно повышалась в составе фосфата/NaCl, но не в составе His/Tre. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 22-23.

Пример 4:

A. Состав, содержащий mAB, можно получать следующими способами.

Состав, содержащий антитело T1h, получают способом, схожим с таковым, приведенным в примере 1.

B. Химическая стабильность водного состава

Образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, не демонстрировали какую-либо нестабильность при ионообменной хроматографии. Различия в деградации наблюдали только в образцах, инкубированных при 40°C.

С применением ионообменной хроматографии образцов, инкубированных при 40°C, четко демонстрируют меньшее повышение содержания кислых вариантов в гистидиновых составах по сравнению с составами на основе фосфатов. Среди гистидиновых составов содержащий трегалозу состав обладает меньшим содержанием кислых вариантов по сравнению с гистидин-сахарозным составом. На фигурах 5 и 6 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени процентная доля вариантов заряда повышалась в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 68,85 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 68,95.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами процентная доля варианта заряда была меньше по сравнению с фосфатными составами. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась только от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 58,62 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 32,63 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 53,78.

Таким образом, следует понимать, что гистидин-трегалозный состав является лучшим составом по результатам ионообменной хроматографии.

По результатам SEC образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, демонстрировали небольшое различие или его отсутствие в профиле деградации среди четырех оцениваемых составов.

Однако, образцы, инкубированные при 40°C, демонстрировали различия по скорости снижения содержания мономеров, как показано на фигуре 8, что, таким образом, влияет на накопление деградантов (HMWP и LMWP).

На фигуре 8 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени снижение % мономеров в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, снижение % мономеров в образцах снижалось от 93,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 86,4 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 92,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 85,0.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами снижение % мономеров в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, снижалось только от 91,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 85,7 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 93,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 89,5.

Это свидетельствует о том, что в гистидин-трегалозном составе скорость деградации мономеров меньше, в то время как в других трех составах, по-видимому, деградация происходит быстрее. То же самое видно на фигуре 9 для повышения содержания деградантов.

На фигуре 9 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % деградантов в образцах снижалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, повышение % деградантов в образцах повышалось от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 13,6 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 7,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 15,0.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % деградантов в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, повышалось только от 8,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 14,3 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 6,7 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 10,5.

Как указано и объяснено ниже, более тщательное наблюдение повышения HMWP и LMWP показывает, что профиль повышения LMWP следует схожей тенденции во всех составах (фигура 10), и она состоит в накоплении HMWP, что отличает гистидиновые составы от составов на основе фосфатов (фигура 11). К концу 5,5 недель, состав является содержащим гистидин/трегалозу составом, имеющим наибольший остаток мономеров, а также наименьший % деградантов.

На фигуре 10 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % LMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, повышение % LMWP в образцах повышалось от 5,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 10,1 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 5,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 11,9.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % LMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, повышалось только от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,8 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 5,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 9,4.

На фигуре 11 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени, повышение % HMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, повышение % HMWP в образцах повышалось от 2,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,5 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 2,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,1.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % HMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 4 недель, снижалось только от 1,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 1,5 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 1,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 1,0.

Результаты SEC на фигурах 14-17 свидетельствуют о том, что в образце фосфата/NaCl содержание агрегатов повышалось в течение 4 недель после повторяемого замораживания-размораживания (-80°C), и в течение 4 недель не наблюдали повышения агрегации в His/Tre-составе. Повышение агрегации составляет приблизительно 1,75% в образце объемом 0,5 мл, и 1,41 % в образце объемом 1 мл.

На фигуре 16 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 1 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,81 [значение в PBS в T2 - после 2 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров повышался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,88 [значение в His-Tre в T2 - после 2 недель].

На фигуре 17 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 0,5 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,28 [значение в PBS в T2 - после 2 недель], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров снижался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,83 [значение в His-Tre в T2 - после 2 недель].

Результаты слабой катионообменной хроматографии на фигурах 18-21 свидетельствуют о том, что распределение вариантов зарядов не изменяется значимо, если в течение четырех недель периода исследования моноклональное антитело T1h повторно замораживают (-80°C) и размораживают в гистидин-трегалозных составах. Однако в образцах фосфата/NaCl повышенные количества белка совместно элюируют с пиком буфера через 40 минут.

С другой стороны, другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 12-13.

Исследование стабильности в замороженном состоянии, представленное на фигурах 24-27, свидетельствует о том, что не наблюдали различий в профиле заряда, но агрегация незначительно повышалась в составе фосфата/NaCl, но не в составе His/Tre. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 22-23.

Пример 5:

A. Состав, содержащий mAB, можно получать следующими способами.

Состав, содержащий антитело T1h, получают способом, схожим с таковым, приведенным в примере 1.

B. Химическая стабильность водного состава

Образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, не демонстрировали какую-либо нестабильность при ионообменной хроматографии. Различия в деградации наблюдали только в образцах, инкубированных при 40°C.

С применением ионообменной хроматографии образцов, инкубированных при 40°C, четко демонстрируют меньшее повышение содержания кислых вариантов в гистидиновых составах, по сравнению с составами на основе фосфатов. Среди гистидиновых составов содержащий трегалозу состав обладает меньшим содержанием кислых вариантов по сравнению с гистидин-сахарозным составом. На фигурах 5 и 6 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени процентная доля вариантов заряда повышалась в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 73,49 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 73,24.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами процентная доля варианта заряда была меньше по сравнению с фосфатными составами. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, процентная доля кислого варианта заряда повышалась только от 33,91 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 62,12 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 32,63 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 57,21.

Таким образом, следует понимать, что гистидин-трегалозный состав является лучшим составом по результатам ионообменной хроматографии.

По результатам SEC образцы, инкубированные при 2-8°C и подвергнутые замораживанию-размораживанию, демонстрировали небольшое различие или его отсутствие в профиле деградации среди четырех оцениваемых составов.

Однако, образцы, инкубированных при 40°C, демонстрировали различия по скорости снижения содержания мономеров, как показано на фигуре 8, что, таким образом, влияет на накопление деградантов (HMWP и LMWP).

На фигуре 8 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени, снижение % мономеров в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, снижение % мономеров в образцах снижалось от 93,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 84,1 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 92,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 84,1.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами снижение % мономеров в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, снижалось только от 91,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 83,5 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 93,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 87,1.

Это свидетельствует о том, что в гистидин-трегалозном составе скорость деградации мономеров меньше, в то время как в других трех составах, по-видимому, деградация происходит быстрее. То же самое видно на фигуре 9 для повышения содержания деградантов.

На фигуре 9 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % деградантов в образцах снижалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, повышение % деградантов в образцах повышалось от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 15,9 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 7,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 15,9.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % деградантов в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, повышалось только от 8,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 16,5 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 6,7 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 12,9.

Как указано и объяснено ниже, более тщательное наблюдение повышения HMWP и LMWP показывает, что профиль повышения LMWP следует схожей тенденции во всех составах (фигура 10), и она состоит в накоплении HMWP, что отличает гистидиновые составы от составов на основе фосфатов (фигура 11). К концу 5,5 недель состав является содержащим гистидин/трегалозу составом, имеющим наибольший остаток мономеров, а также наименьший % деградантов.

На фигуре 10 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % LMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, повышение % LMWP в образцах повышалось от 5,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,1 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 5,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 12,1.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % LMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, повышалось только от 7,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 15,0 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 5,4 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 11,8.

На фигуре 11 показано, что при наблюдении после определенных промежутков времени повышение % HMWP в образцах повышалось в ряду от фосфат-сахарозных составов до фосфат-трегалозного состава. Если это наблюдали для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, повышение % HMWP в образцах повышалось от 2,0 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,8 для фосфат-сахарозных составов, в то время как для фосфат-трегалозных составов - от 2,2 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 3,8.

С другой стороны, при наблюдении за гистидиновыми составами повышение % HMWP в образцах для составов, инкубированных при 40°C в течение 5 недель, снижалось только от 1,6 [значение при 40°C в уточненное Т0] до 1,5 для гистидин-сахарозных составов, в то время как для гистидин-трегалозных составов - от 1,3 [значение при 40°C в уточненное Т0] только до 1,1.

Результаты SEC на фигурах 14-17 свидетельствуют о том, что в образце фосфата/NaCl содержание агрегатов повышалось в течение 4 недель после повторяемого замораживания-размораживания (-80°C) и в течение 4 недель не наблюдали повышения агрегации в His/Tre-составе. Повышение агрегации составляет приблизительно 1,75% в образце объемом 0,5 мл, и 1,41 % в образце объемом 1 мл.

На фигуре 16 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 1 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 96,88 [значение в PBS в T1 - после 1 недели], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров повышался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 97,91 [значение в His-Tre в T1 - после 1 недели].

На фигуре 17 показано, что при наблюдении распределения вариантов размера после определенных промежутков времени в образцах 0,5 мл при повторяемом замораживании-размораживании (-80°C) % мономеров в фосфатно-солевом буфере снижался от 97,67 [значение в PBS в T0] до 97,42 [значение в PBS в T1 - после 1 недели], в то время как в гистидин-трегалозном составе % мономеров повышался от 97,86 [значение в His-Tre в T0] до 98,02 [значение в His-Tre в T1 - после 1 недели].

Результаты слабой катионообменной хроматографии на фигурах 18-21 свидетельствуют о том, что распределение вариантов зарядов не изменяется значимо, если в течение четырех недель периода исследования моноклональное антитело T1h повторно замораживают (-80°C) и размораживают в гистидин-трегалозных составах. Однако, в образцах фосфата/NaCl повышенные количества белка совместно элюируют с пиком буфера через 40 минут.

С другой стороны, другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 12-13.

Исследование стабильности в замороженном состоянии, представленное на фигурах 24-27, свидетельствуют о том, что не наблюдали различий в профиле заряда, но агрегация незначительно повышалась в составе фосфата/NaCl, но не в составе His/Tre. Другие параметры, такие как pH, концентрация, не свидетельствуют о превосходстве одного состава над другим, как показано на фигурах 22-23.