СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОКАИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения новокаина в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения новокаина в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект обрабатывают смесью ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, подвергают процессу перколяции с использованием в качестве извлекающего агента смеси ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, при этом элюирование анализируемого вещества осуществляют со скоростью 5-6 мл/мин, элюат отделяют, подщелачивают 25% раствором аммиака до pH 10,0, насыщают хлоридом натрия для разделения водного и ацетонового слоев, встряхивают, ацетоновый слой отделяют, водный слой дважды встряхивают с ацетоном, ацетоновые экстракты объединяют, ацетон из объединенного экстракта упаривают, водный остаток охлаждают, обрабатывают ацетоном, образовавшийся осадок отфильтровывают, ацетон упаривают из фильтрата, водный остаток подкисляют концентрированной хлороводородной кислотой до pH 2-3, встряхивают с эфиром, эфирный экстракт удаляют, водный слой подщелачивают раствором аммиака до pH 10,0, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирный экстракт упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм с использованием двухкомпонентной подвижной фазы диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и определяют методом фотометрии (Садыков З.К., Икрамов Л.Т. Обнаружение новокаина и n-аминобензойной кислоты в трупном материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 1990. - Т.33, №4. - С.32-34).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и не предусматривает возможности количественного определения новокаина.

Известен способ определения новокаина в биологическом материале путем неоднократного настаивания биологического объекта с 1 М раствором хлорной кислоты, очистки полученного извлечения с применением сорбции в колонке с полиамидом, элюирования из сорбента 95% этанолом, переведения анализируемого вещества, элюированного из колонки, в азокраситель при использовании в качестве азосоставляющего 3-α,γ-дикарбоксипропилроданина и последующего фотометрирования образующегося окрашенного раствора (Вощинина Н.А. Химико-токсикологическое исследование производных n-аминобензойной кислоты (анестезина, новокаина, новокаинамида): Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Курский государственный медицинский университет. - Курск, 2000. - С.9-10, 12-13).

Способ отличается недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.

Наиболее близким является способ определения новокаина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект обрабатывают ацетоном, содержащим 30% воды, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, биоматериал на фильтре промывают ацетоном, содержащим 30% воды, контролируя полноту выделения анализируемого вещества из биологического объекта реакцией образования азокрасителя, извлечение объединяют с порциями промывной жидкости, объединенное извлечение насыщают хлоридом натрия для разделения фаз, образующуюся ацетоновую фазу отделяют, упаривают из нее ацетон при 50°C на водяной бане, водный остаток объединяют с водно-солевой фазой, объединенный раствор подщелачивают раствором аммиака до pH 10, экстрагируют диэтиловым эфиром, растворитель из эфирного экстракта испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, после проявления хроматограммы анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием в набивной колонке длиной 100 м и внутренним диаметром 0,3 см, заполненной неподвижной фазой, представляющей собой 3% SE-30 на инертном носителе Supelcoport (80-120 меш), при температуре термостата колонки 190°C, испарителя - 250°C, с использованием в качестве газа-носителя азота, который пропускается со скоростью 60 мл/мин, скорость пропускания водорода составляет 40 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин (Садиков З.К. Изолирование, обнаружение и определение новокаина и n-аминобензойной кислоты при судебно-химических исследованиях: Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова. - Москва, 1990. - С.11, 13, 14-16).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий новокаин, измельчают, трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани печени

К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани печени прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.

Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.

Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 мл 0,025% раствора новокаина в метаноле и доводят объем содержимого каждой колбы до метки метанолом.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в испаритель газожидкостного хроматографа.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10^-9-2,0·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=124092·C+859,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения новокаина в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани легких

К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани легких прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.

Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.

Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения новокаина в ткани легких представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,0·10² раз повышает чувствительность определения в детектируемой пробе и в 1,6·10² раз - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Таблица 1 Результаты определения новокаина в ткани печени (n=5; p=0,95) № Внесено новокаина, мг в 10 г ткани печени Найдено Метрологические характеристики, % площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески 1 10,00 9076452 7,314·10-5 9,142 91,42 2 10,00 8652553 6,972·10-5 8,715 87,15 S=3,71 3 10,00 9484466 7,642·10-5 9,553 95,53 4 10,00 9420931 7,591·10-5 9,489 94,89 5 10,00 8797493 7,089·10-5 8,861 88,61

Таблица 2 Результаты определения новокаина в ткани легких (n=5; р=0,95) № Внесено новокаина, мг в 10 г ткани легких Найдено Метрологические характеристики, % площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески 1 10,00 8953352 7,214·10-5 9,018 90,18 2 10,00 9535096 7,683·10-5 9,604 96,04 S=3,58 3 10,00 8762747 7,061·10-5 8,826 88,26 4 10,00 9515241 7,667·10-5 9,584 95,84 5 10,00 8964272 7,223·10-5 9,029 90,29