СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОКАИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения прокаина в плазме крови, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения прокаина в биологических жидкостях (моче), заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают гидрокарбонатом натрия, доводят pH до 8,4-8,6, экстрагируют в течение 5 минут органическим экстрагентом, представляющим собой смесь хлороформа и изобутанола, взятых в соотношении 6:1, при соотношении объемов водной и органической фаз 0,3:1, экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия, сульфат натрия промывают хлороформом, фильтрат и промывную жидкость объединяют, в объединенный раствор вводят внутренний стандарт, которым является циклизин, растворитель из полученного раствора испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в ацетилирующем реагенте, представляющим собой смесь уксусного ангидрида и пиридина, взятых в соотношении 3:2 по объему, образующуюся реакционную смесь нагревают в течение 20 минут при температуре 80°C, избыток ацетилирующего реагента испаряют в токе воздуха при температуре 40°C, остаток растворяют в этилацетате и определяют количество анализируемого вещества методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (Мелентьев А.Б. Скрининг лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором // Проблемы экспертизы в медицине. - Т.2, №4. - С.15-21).

Способ отличается относительно низкой степенью извлечения и недостаточно высокой точностью определения.

Известен способ определения прокаина в плазме крови, состоящий в том, что к анализируемой пробе прибавляют фторид натрия для создания концентрации 7,5 мг/мл, доводят реакцию среды полученной смеси до pH 11 с помощью бикарбонатного буфера, экстрагируют дихлорметаном при соотношении объемов водной и органической фаз 1:1,2, экстракт отделяют, упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в деионизированной воде и определяют количество анализируемого соединения по площади хроматографического пика методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-селективным детектированием (Zientek K.D., Anderson D.F., Wegner K., Cole C. Quantitatio of Procaine in Equine Plasma by Liquid Chromatography - Linear Ion Trap Mass Spectrometry // Journal of Analytical Toxycology. - 2007. - Vol.31. - P.87-92).

Способ отличается недостаточно высокой точностью определения и относительно низкой степенью извлечения.

Наиболее близким является способ определения прокаина в биологических жидкостях, состоящий в том, что в анализируемую пробу вводят фторид натрия для создания концентрации 5 мг/мл, добавляют внутренний стандарт, в качестве которого используют тетракаин, образующийся раствор подщелачивают боратным буферным раствором до 9,5, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используется дихлорэтан, при соотношении водной и органической фаз 0,6-1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, экстрагент испаряют до сухого остатка в токе азота в условиях нагревания при 60°C, остаток растворяют в метаноле, хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Radial Pak C₁₈», полярной подвижной фазы ацетонитрил - 0,0165 М раствор триэтиламина в соотношении 85:15 по объему и УФ-детектора, регистрирют оптическую плотность при длине волны 288 нм и вычисляют количество анализируемого соединения по площади хроматографического пика (Beaumier P., Timmings S., Fenwick J.D., Fodi F., Young L.M., Yeow Т., Weber М., Stevenson A.J. Procaine Determination after Administering Various Procaine Formulations to Standard-breds // Proceedings of the 6 th International Conference of Racing Analysis and Veterinarians. - Hong Kong, 1985. - P.209-216).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что в анализируемую пробу вводят фторид натрия для создания концентрации 10 мг/мл, полученную смесь обрабатывают ацетоном, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют путем прибавления воды, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток хроматографируют в тонком слое силикагеля СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, применяя подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 6:4 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента смесью ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему, хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nucleosil C18», полярной подвижной фазы ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему и УФ-детектора, регистрирют оптическую плотность при длине волны 298 нм и вычисляют количество анализируемого соединения по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: в плазму крови, содержащую прокаин, вводят фторид натрия для создания концентрации 10 мг/мл, полученную смесь обрабатывают ацетоном, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют путем прибавления воды, образующийся раствор насыщают сульфатом аммония, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток хроматографируют в тонком слое силикагеля СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, применяя подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 6:4 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента смесью ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему, хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nucleosil C18», полярной подвижной фазы ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия с pH 3,0 в соотношении 10:10:90 по объему и УФ-детектора, регистрируют оптическую плотность при длине волны 298 нм и вычисляют количество анализируемого соединения по площади хроматографического пика.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение прокаина в плазме крови человека

В 5 см³ плазмы крови человека вносят 40 мкг прокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в виде 0,1 см³ 0,04% раствора, в анализируемую пробу вводят 51 мг фторида натрия для создания концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом в течение 2 минут. Полученную смесь обрабатывают 10 см³ ацетона в течение 10 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр, а осадок повторно обрабатывают 10 см³ ацетона в течение 10 минут при перемешивании и фильтруют извлечение через бумажный фильтр, который использовался для фильтрования первого извлечения. Фильтр дополнительно промывают 5 см³ ацетона. Фильтрат и промывную жидкость объединяют и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатной температуре.

Водный остаток разбавляют путем прибавления 5 см³ воды, образующийся раствор насыщают сульфатом аммония, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, доводят объем образующегося раствора до 10 см³, экстрагируют 10 см³ 30% раствора камфоры в этилацетате в течение 10 минут, экстракционную систему оставляют на 3-5 минут для расслаивания, органический экстракт отделяют, а процесс экстракции повторяют по вышеописанной схеме. Отдельные экстракты объединяют в выпарительной чашке, упаривают до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

Остаток растворяют в незначительном объеме этанола и количественно переносят на линию старта хроматографической пластины типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ размерами 10×7 см в виде полосы длиной 3-3,5 см и шириной 0,4-0,5 см. Хроматографируют в присутствии веществ-свидетелей прокаина и камфоры в стеклянной камере с внутренним объемом 600 см³, применяя элюент дихлорметан-этанол в соотношении 6:4 по объему. Полученные хроматограммы проявляют в Уф- свете. Анализируемое вещество (прокаин) идентифицируют по величине Rf, совпадающей с величиной Rf вещества-стандарта и составляющей в данных условиях 0,33±0,02.

После хроматографирования методом ТСХ участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезают, помещают в пробирку, элюируют вещество из сорбента 5 мл смеси ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0) в соотношении 10:10:90 по объему. 1,0·10^-2 см³ полученного раствора вводят в хроматограф типа «Милихром - 5» с УФ-детектором.

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 80×2 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nucleosil C18» (размер частиц 5 мкм) с применением подвижной фазы ацетонитрил-метанол-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0 за счет добавления H₃PO₄) в соотношении 10:10:90 по объему. Скорость подачи элюента - 0,1 см³/мин. Хроматографический процесс осуществляют при 20°C. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 298 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживанием 5,73 мин (объемом удерживания 573 мкл) соответствует прокаину.

Количественное содержание прокаина определяют исходя из площади хроматографического пика, по уравнению градуировочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в плазму крови человека.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,25, 1,0, 2,5, 5,0; 10,0 мл 0,005% раствора прокаина в смеси растворителей ацетонитрил-метанол - 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0 за счет добавления H₃PO₄) в соотношении 10:10:90 по объему и доводят до метки смесью растворителей ацетонитрил-метанол - 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0 за счет добавления H₃PO₄) в соотношении 10:10:90. 1,0·10^-2 см³ каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 80×2 мл, заполненной сорбентом «Nucleosil C18» (размер частиц 5 мкм), используя подвижную фазу ацетонитрил-метанол - 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0 за счет добавления H₃PO₄) в соотношении 10:10:90 по объему и УФ-детектор. Скорость подачи элюента составляет 0,1 см³/мин.

Хроматографический процесс осуществляют при 20°C. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 298 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10^-10-2·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=295,4721·С+0,2759,

где S - площадь хроматографического пика, С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты определения прокаина в плазме крови человека представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение прокаина в плазме крови лошади

В 5 г плазмы крови лошади вносят 40 мкг прокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в виде 0,1 см³ 0,04% раствора, в анализируемую пробу вводят 51 мг фторида натрия для создания концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом в течение 2 минут. Полученную смесь обрабатывают 10 см³ ацетона в течение 10 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр, а осадок повторно обрабатывают 10 см³ ацетона в течение 10 минут при перемешивании и фильтруют извлечение через бумажный фильтр, который использовался для фильтрования первого извлечения. Фильтр дополнительно промывают 5 см³ ацетона. Фильтрат и промывную жидкость объединяют и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатной температуре.

Водный остаток разбавляют путем прибавления 5 см³ воды, образующийся раствор насыщают сульфатом аммония, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, доводят объем образующегося раствора до 10 см³, экстрагируют 10 см³ 30% раствора камфоры в этилацетате в течение 10 минут, экстракционную систему оставляют на 3-5 минут для расслаивания, органический экстракт отделяют, а процесс экстракции повторяют по вышеописанной схеме. Отдельные экстракты объединяют в выпарительной чашке, упаривают до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

Остаток растворяют в незначительном объеме этанола и количественно переносят на линию старта хроматографической пластины типа «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ размерами 10×7 см в виде полосы длиной 3-3,5 см и шириной 0,4-0,5 см. Хроматографируют в присутствии веществ-свидетелей прокаина и камфоры в стеклянной камере с внутренним объемом 600 см³, применяя элюент дихлорметан-этанол в соотношении 6:4 по объему. Полученные хроматограммы проявляют в УФ- свете. Анализируемое вещество (прокаин) идентифицируют по величине Rf, совпадающей с величиной Rf вещества-стандарта и составляющей в данных условиях 0,33±0,02.

После хроматографирования методом ТСХ участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезают, помещают в пробирку, элюируют вещество из сорбента 5 мл смеси ацетонитрил-метанол - 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0) в соотношении 10:10:90 по объему. 1,0·10^-2 см³ полученного раствора вводят в хроматограф типа «Милихром-5» с УФ-детектором.

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 80×2 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nucleosil C18» (размер частиц 5 мкм) с применением подвижной фазы ацетонитрил-метанол - 0,025 М раствор дигидрофосфата калия (pH 3,0 за счет добавления H₃PO₄) в соотношении 10:10:90 по объему. Скорость подачи элюента - 0,1 см³/мин. Хроматографический процесс осуществляют при 20°C. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 298 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживанием 5,73 мин (объемом удерживания 573 мкл) соответствует прокаину.

Количественное содержание прокаина определяют исходя из площади хроматографического пика, по уравнению градуировочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в плазму крови лошади.

Схема построения градуировочного графика для определения прокаина и уравнение этого графика представлены выше в примере 1.

Результаты определения прокаина в плазме крови лошади представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2-8 раз повышает чувствительность определения и на 8-9% повышает степень извлечения прокаина из плазмы крови.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.

Таблица 1 Результаты определения прокаина в плазме крови человека (n=5; P=0,95) № Внесено прокаина, мкг в 5 см3 плазмы крови человека Найдено Метрологические характеристики, % площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мкг в хроматографируемой пробе мкг в пересчете на навеску, внесенную в биожидкость % от внесенной в биожидкость навески 1 40 23362,78 7,906·10-2 39,532 98,83 2 40 22086,34 7,474·10-2 37,368 93,42 S=3,47 3 40 23803,04 8,055·10-2 40,276 100,69 4 40 24197,37 8,158·10-2 40,792 101,98 5 40 22744,56 7,690·10-2 38,448 96,12

Таблица 2 Результаты определения прокаина в плазме крови лошади (n=5; P=0,95) № Внесено прокаина, мг в 5 см3 плазмы крови лошади Найдено Метрологические характеристики, % площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мкг в хроматографируемой пробе мкг в пересчете на навеску, внесенную в биожидкость % от внесенной в биожидкость навески 1 40 24131,01 8,166·10-2 40,832 102,08 2 40 23303,69 7,886·10-2 39,428 98,57 S=3,28 3 40 23909,41 8,091·10-2 40,456 101,14 4 40 22417,27 7,586·10-2 37,928 94,82 5 40 25547,28 7,630·10-2 38,152 95,38