Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СНИЖЕНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К КОКЛЮШУ У ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВРЕДНЫХ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки влияния неблагоприятных химических факторов антропогенного происхождения, в частности хрома и марганца, на изменение поствакцинального иммунитета у детей к коклюшу. Метод может быть использован для проведения эпидемиологических исследований, расследований, экспертиз и направлен на объективную оценку иммунологической эффективности вакцинопрофилактики и выявление контингента детей, проживающих в условиях воздействия вредных химических факторов, таких как хром и марганец, в отношении которых необходимо осуществление дополнительных мероприятий, направленных на повышение эффективности вакцинации вакциной АКДС - адсорбированной (цельноклеточной) коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной.

Для понимания сущности вопроса ниже приведены следующие пояснения.

В 2011 г. вакцинопрофилактика коклюша была осуществлена у 98,1% детей РФ. Ретроспективный анализ показал, что среди заболевших высокий удельный вес составляли привитые лица, что свидетельствует о недостаточном уровне поствакцинального иммунитета у отдельных категорий населения. Установлено, что антропогенное загрязнения среды обитания является одним из ведущих факторов риска формирования у 35%-51,9% детей низкого уровня специфических поствакцинальных антител. На территориях антропогенного загрязнения среды обитания число детей с максимальным содержанием поствакцинальных антител в 7-8 раз ниже аналогичного показателя у лиц, проживающих в условиях относительного санитарно-гигиенического благополучия. По данным литературы у детей 10-14 лет, проживающих на территориях антропогенного загрязнения, установлено отсутствие защитных уровней антител к коклюшу в 90% случаев, несмотря на проведение плановой вакцинации.

Следует отметить, что в настоящее время отсутствуют методические подходы к оценке нарушений поствакцинального иммунитета у детей, проживающих в условиях антропогенного загрязнения среды обитания, не разработан алгоритм формирования доказательной базы роли химических токсикантов в развитии этих нарушений, наличие которой позволит разработать комплекс дополнительных мероприятий, направленных на повышение эффективности вакцинопрофилактики коклюша у детей.

Из Методических указаний “МУ 3.1.2943-11. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит В)” (утв. Роспотребнадзором 15.07.2011), известен способ определения количества антител к коклюшу методом РПГА (реакция непрямой гемагглютинации). Однако указанный известный метод дает определение не поствакцинальных антител, а всех антител к возбудителю коклюша. Его результаты зачастую являются недостоверными и не выявляют детей с нарушениями именно поствакцинального иммунитета, т.к. защиту ребенка при встрече с возбудителем коклюша обеспечивают не все антитела, а именно поствакцинальные. Кроме того, этот известный способ не учитывает влияние химических веществ-загрязнителей, таких как хром и марганец, на количество антител к коклюшу, что также снижает достоверность выводов.

Также известен Способ определения напряженности клеточного поствакцинального иммунитета in vitro (Заявка на Патент РФ №2008136596), согласно которому проводят инкубацию периферической крови пациента с физиологическим раствором в качестве контрольной пробы и водным раствором исследуемой вакцины в качестве опытной пробы, последующую обработку опытной и контрольной проб гемолизирующей смесью и определение в каждой пробе СрИФ с помощью лазерного проточного цитофлюориметра, при этом в тест-системе in vitro используют широкий спектр вакцин (АКДС, АДСМ, коревую, паротитную, полиомиелитную, гепатитную, против краснухи и др.), определяют коэффициент напряженности (КН) по формуле

и если значение КН находится в пределах менее 20%, делают заключение об отсутствие защитного поствакцинального иммунитета, в пределах от 20 до 40% делают заключение о гипоэргической, в пределах от 40 до 60% - нормэргической, превышает 60% - гиперэргической напряженности клеточного поствакцинального иммунитета.

Однако указанный известный способ имеет следующие недостатки:

- не является селективным именно в отношении коклюша;

- не принимает во внимание антропогенные характеристики среды обитания ребенка, что приводит к снижению точности.

Известен Способ определения выраженности клеточного иммунитета у мышей, иммунизированных коклюшной вакциной, путем культивирования взвеси исследуемых иммунокомпетентных клеток с антигеном, с последующим определением миграционной способности клеток (Авт. свид-во СССР №793566). Этот способ характеризуется теми же недостатками, что и вышеприведенные аналоги.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в обеспечении диагностики нарушения поствакционального иммунитета к коклюшу у детей, подверженных воздействию химических токсикантов среды обитания, таких как хром и марганец.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики снижения поствакцинального иммунитета к коклюшу у детей, проживающих в условиях воздействия вредных факторов, таких как хром и марганец, согласно которому при одновременном повышенном содержании в крови ребенка хрома более 0,004 мг/дм³ и марганца более 0,011 мг/дм³ и пониженным по сравнению с протективным уровнем количеством поствакцинальных антител класса IgG к возбудителю коклюша, диагностируют снижение поствакцинального иммунитета ребенка к коклюшу.

Для более полного понимания возможности достижения технического результата следует рассмотреть не только характеристики предлагаемого способа, но и этапы исследований.

Благодаря тому, что на территории проживания определяют перечень конкретных химических веществ-загрязнителей среды обитания, для которых иммунная система является мишенью, обеспечивается практически полный учет приоритетных химических факторов риска для формирования поствакцинального иммунитета к коклюшу ребенка, что позволяет учесть их негативное влияние и повысить достоверность определения. При этом из источника информации «Воздействие на организм человека опасных и вредных экологических факторов. Метрологические аспекты», (в 2-х томах) / Под ред. Исаева Л.К. - М. - 1997. - I том. - 509 с. известно, что, например, такие вещества, как хром и марганец, негативно влияют на иммунную систему человека.

Благодаря тому, что для установленных веществ-загрязнителей осуществляют оценку риска развития нарушений со стороны иммунной системы по критерию индекса опасности HI более 1,0 («Руководство по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» Р 2.1.10.1920-04), обеспечивается определение селитебных территорий, на которых у детского населения развитие нарушений формирования поствакцинального иммунитета к коклюшу является наиболее вероятным.

Отбор вакцинированных детей, проживающих в указанных условиях, у которых отсутствуют заболевания иммунной системы, обусловлен тем, что важным фактором является выявление таких детей с низким поствакцинальным иммунитетом к коклюшу еще на ранней стадии без клинических проявлений, чтобы в дальнейшем была возможность провести профилактические мероприятия для этих детей с целью исключения их заболевания коклюшем.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы венозной крови обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности. Установление содержания химического контаминанта (вещества-загрязнителя) именно в крови обусловлено тем, что кровь является самой гомеостатичной средой (управляемость и регулируемость концентраций составляющих ее компонентов) и единственной, имеющей реферируемые константы в отношении техногенных химических веществ, в частности таких, как хром и марганец.

При дальнейшем отборе детей для проведения исследований использовали такой критерий, как: в пробе крови количество выбранных химических веществ - загрязнителей среды обитания превышало референтный (для металлов) или фоновый региональный уровень (для ароматических углеводородов) не менее чем на 20%. Это обусловлено тем, что согласно источнику информации («Биомаркеры эффекта при воздействии техногенных химических факторов окружающей и производственной среды в системе санитарно-гигиенического анализа» О.В. Долгих, М.А. Землянова. Гигиенические и медико-профилактические технологии управления рисками здоровью населения в промышленно развитых регионах. Мат. Научно-практ. Конф. С международным участием (Пермь, 6-8 октября 2010 г.) с.14-19), именно при таком превышении обеспечивается достоверное влияние химических токсикантов на основные показатели гомеостаза организма ребенка.

Использование для исследования метода иммуноферментного анализа (ИФА) со специфическими тест-системами, посредством которого определяют количество поствакцинальных антител класса иммуноглобулина G к возбудителю коклюша в сыворотке крови, обусловлено следующим. Основными преимуществами ИФА являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность одновременного исследования большого количества проб с определением специфических антител различных классов, объективная оценка результатов с помощью спектрофотометра (автоматического ИФА-анализатора), простота постановки и возможность использования внутреннего контроля. В результате этого анализа выявляют лиц, у которых количество поствакцинальных антител к возбудителю коклюша ниже протективного уровня.

Благодаря тому, что при реализации предлагаемого способа устанавливают для этих лиц корреляционную связь снижения количества указанных антител от содержания в крови химических веществ-загрязнителей, таких как хром и марганец, обеспечивается доказательство влияния повышенного содержания этих конкретных химических токсикантов на формирование поствакцинального иммунитета к коклюшу.

А достоверное прогнозирование снижения поствакцинального иммунитета ребенка к коклюшу при реализации предлагаемого способа обеспечивается в том случае, если выявлены одновременно достоверные зависимости: повышенное содержание в крови ребенка хрома более 0,004 мг/дм³ и марганца более 0,011 мг/дм³ и пониженное количество поствакциональных антител класса IgG к возбудителю коклюша по сравнению с протективным уровнем. Числовые значения количества хрома и марганца были установлены экспериментальным путем (рис.1 и рис.2). На рис.1 показана связь снижения содержания поствакцинального IgG к возбудителю коклюша при увеличении в крови концентрации хрома. На рис.2 показана связь снижения содержания поствакцинального IgG к возбудителю коклюша при увеличении в крови концентрации марганца. И как неожиданно оказалось, они характеризуют максимально недействующую концентрацию этих веществ на организм ребенка. При этом указанную максимально недействующую концентрацию определяли согласно методике количественной оценки неканцерогенного риска факторов среды обитания (Шур П.З., Зубарев А.Ю., Шарифов А.Т. Методические подходы к разработке критериев для количественной оценки неканцерогенного риска факторов среды обитания по результатам эпидемиологических исследований // Сборник материалов Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 140-летию образования первой гигиенической кафедры в России «Профилактическая медицины в России: истоки и современность». - Казань: ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Росздрава». - 2009. - Т.2. - С.105-106). И эти данные о концентрации были подтверждены и нижеприведенными исследованиями, характеризующими пример реализации предлагаемого способа.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием вредных химических факторов, обусловленных экологической средой обитания. На выбранной территории проживания детей группы наблюдения (крупный промышленный центр с многопрофильным производством) ежегодно в атмосферный воздух от стационарных источников поступает более 900 тонн загрязняющих веществ (в том числе соединения хрома, марганца, свинца, фенола и крезолов), среди которых вещества 1-3 классов опасности составляют более 77% (759,6 т/год). Натурные исследования атмосферного воздуха в зонах экспозиции позволили идентифицировать в отобранных пробах хром, свинец, марганец в концентрациях до 1,5 ПДК с.с. и o-крезолы, фенол - до 2,3-4,0 ПДК с.с. Все эти вещества в концентрациях выше 1 ПДК с.с. способны вызывать нарушения со стороны иммунной системы, см. «Руководство по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду». (Руководство Р 2.1.10.1920-04). - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 143 с.

Одновременно выбирали территорию экологического благополучия на территории проживания детей группы сравнения (поселок городского типа), качество атмосферного воздуха в котором соответствовало гигиеническим нормативам как по данным мониторинговых наблюдений, так и по результатам натурных исследований. Факторы антропогенного происхождения в концентрациях менее 1 ПДКс.с.

2. Далее проводили оценку риска развития у детского населения нарушений со стороны иммунной системы по критерию индекса опасности (Н1>1,0) (Оценка риска развития нарушений со стороны иммунной системы осуществляется по стандартизованной методике в соответствии с «Руководство по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду». (Руководство Р 2.1.10.1920-04). - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 143 с.).

В ходе исследований, проведенных на указанной выбранной территории проживания детей группы наблюдения, установлен неприемлемый риск развития иммунных нарушений (Н1>1,0) при ингаляционном поступлении следующих установленных соединений (хром, свинец, марганец, o-крезолы, фенол). Результаты эпидемиологических исследований выявили причинно-следственную связь между изучаемыми химическими факторами риска и возникновением иммунных нарушений (ОШ - отношение шансов = 2,56; ДИ - доверительный интервал = 1,05-6,26). Поэтому все установленные вещества принимаются во внимание при установлении нарушения поствакцинального иммунитета к коклюшу.

Оценка риска развития иммунных нарушений, связанных с неблагоприятным воздействием химических факторов среды обитания, выполненная на территории проживания детей группы сравнения, показала отсутствие риска (HI<1,0).

3. Проводят отбор детей, проживающих на указанной территории. В исследование были включены 276 детей (219 - группа наблюдения, 57 - группа сравнения) в возрасте 4-6 лет, у которых, в соответствии с «Национальным календарем прививок», была выполнена плановая вакцинация вакциной АКДС (базовая вакцинация в возрасте 3; 4,5 и 6 месяцев жизни и первая ревакцинация в 18 месяцев) и не имевших поствакцинальных реакций. Из исследования исключены дети с патологией, сопровождающейся развитием иммунных нарушений.

4. Далее у указанных детей были взяты пробы крови, в которых устанавливали количество выбранных вредных химических веществ среды обитания (хром, свинец, марганец, o-крезолы, фенол). Химико-аналитические исследования содержания металлов (марганец, свинец, хром) в биосубстратах (кровь) проводится методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на спектрофотометре PERKIN-ELMER-3110 (США) (регистрационный номер в Государственном реестре №14427-95) с атомизацией в пламени и масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой ICP-MS фирмы Agilent 7500 cx (США) (регистрационный номер в Государственном реестре №24863-08). Исследование содержания фенола и o-крезола в биосубстратах (кровь) проводится методом капиллярной газовой хроматографии и парафазного анализа в соответствии с методическими указаниями (МУК 4.1.763-4.1.779-99; МУК 4.1.2102-4.1.2116-06). Все исследования выполняются с использованием газового хроматографа (модели 6890, 6890N, 6850, 7890А, Рег. №15118-07, страна производитель США), аппаратно-программного комплекса «Хроматэк-Кристалл-5000» (№ ФСР 2009/04091, ТУ 9443-004-12908609-99). Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в табл.1.

Статистическая обработка материала проводится с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Office Excel 2010» и Statistica 6.0. При оценке содержания в крови химических веществ и соединений рассчитываются средние величины и ошибки средних. Статистическую достоверность различий оценивают по непарному t-критерию Стьюдента. Для отклонения нулевой гипотезы (отсутствие различий) принимают уровни статистической значимости р<0,05.

Результаты исследования крови (табл.1) детей группы наблюдения показали, что содержание марганца (0,021±0,003 мг/дм³), свинца (0,131±0,013 мг/дм³), хрома (0,0191±0,0035 мг/дм³), фенола (0,0494±0,0071 мг/дм³) и o-крезола (0,0143±0,0046 мг/дм³) достоверно (р=0,01-0,0001) в 1,4-4 раз превышало референтные/фоновые уровни. Кроме того, содержание данных химических веществ было в 1,2-4,9 раза выше аналогичных показателей детей группы сравнения (марганец - 0,013±0,0024 мг/дм³, свинец - 0,109±0,009 мг/дм³, хром - 0,0107+0,0020 мг/дм³, фенол - 0,0087±0,0004 мг/дм³, o-крезол - 0,0033±0,0012 мг/дм³; р=0,03-0,0001).

5. Для дальнейшего исследования из числа детей в группе наблюдения были выбраны дети, у которых количество вредных веществ превышало референтный (по металлам), фоновый (по органическим соединениям) уровень не менее чем на 20%. Такой подход обусловлен установленным порогом развития нарушений реакций поддержания гомеостаза у детей при повышении концентрации химических веществ техногенного происхождения в крови относительно референтных/фоновых («Биомаркеры эффекта при воздействии техногенных химических факторов окружающей и производственной среды в системе санитарно-гигиенического анализа» О.В. Долгих, М.А. Землянова. Гигиенические и медико-профилактические технологии управления рисками здоровью населения в промышленно развитых регионах. Мат. Научно-практ. Конф. С международным участием (Пермь, 6-8 октября 2010 г.) с.14-19).

6. Далее в сыворотке крови выбранных лиц определяют количество поствакцинальных антител класса IgG к возбудителю коклюша. Для этого использовали метод иммуноферментного анализа на полуавтоматическом иммуноанализаторе «ELx808» с использованием тест-системы «RIDASCREEN Bordetella IgG ELISA», предназначенной для количественного in vitro определения антител класса IgG к коклюшному анатоксину (Bordetella Toxoid) в сыворотке крови.

Оценка состояния поствакцинального иммунитета к коклюшу проведена через три, четыре и пять лет после первой ревакцинации АКДС на основании исследования содержания циркулирующих специфических поствакцинальных антител. Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в табл.2.

Анализ среднегрупповых показателей содержания поствакцинальных антител к коклюшу показал, что их уровень в обеих исследуемых группах в анализируемые сроки после первой ревакцинации/вакцинации соответствует протективному. В группе наблюдения уровень поствакцинальных антител к возбудителю коклюша составлял: min - 19,13 Ед/мл (протективный уровень - 14,0-18,0 Ед/мл, р=0,02), max - 39,19 Ед/мл (р<0,001). В тоже время у детей группы наблюдения через 4 года после первой ревакцинации АКДС уровень антител к возбудителю коклюша (30,07±7,69 Ед/мл) в 1,4 раза ниже показателей группы сравнения (43,31±2,0 Ед/мл р=0,001).

Для углубленной оценки иммунологической эффективности вакцины АКДС в изучаемых группах была проанализирована частота нарушений формирования поствакцинального иммунитета к коклюшу (табл.3).

Результаты исследования, приведенные в табл.3, показали, что у 50-67% детей группы наблюдения и 21-46% детей группы сравнения содержание поствакцинальных антител не обеспечивало протективного уровня иммунитета к коклюшу, при этом частота случаев формирования у привитых детей группы наблюдения низких титров поствакцинальных антител была в 1,8-2,0 раза выше группы сравнения (р=0,03-0,0001).

Содержание поствакцинальных противококлюшных антител на протективном уровне и выше в группе наблюдения имели только 46-50% детей, в то время как в группе сравнения таких детей было в 1,5-1,6 раза больше (70-78%, р=0,003-0,0001). В целом, в группе наблюдения количество детей с уровнем противококлюшных антител ниже протективного в 1,5-2,4 раза (р=0,03-0,0001) превышало показатель группы сравнения (табл.3).

7. Выделяют лиц, у которых количество поствакцинальных антител класса IgG к возбудителю коклюша ниже протективного уровня, и устанавливают для этих лиц корреляционную связь снижения количества указанных антител от содержания в крови выбранных химических веществ - загрязнителей среды обитания. Статистическая обработка материала проводится с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Office Excel 2010» и Statistica 6.0. При оценке содержания в крови химических веществ и соединений рассчитываются средние величины и ошибки средних. Статистическую достоверность различий оценивают по непарному t-критерию Стьюдента. Для отклонения нулевой гипотезы (отсутствие различий) принимают уровни статистической значимости р<0,05. Математическое моделирование включает анализ отношения шансов изменения показателей поствакцинального иммунитета при возрастании концентрации химических веществ в биологических средах.

8. Далее устанавливают причинно-следственную связь снижения количества антител класса IgG к возбудителю коклюша от содержания в крови выбранных химических веществ - загрязнителей среды обитания. Анализ показателя отношения шансов изменения уровня поствакцинального специфического иммунитета при различном уровне токсикантной нагрузки позволил установить достоверную связь: повышенное содержание в крови ребенка хрома более 0,004 мг/дм³ и марганца более 0,011 мг/дм³ и пониженное количество поствакциональных антител класса IgG к возбудителю коклюша. Результаты приведены на рис.1 и рис.2. С другими химическими токсикантами (свинец, o-крезол, фенол) причинно-следственная связь снижения количества антител класса IgG к возбудителю коклюша не выявлена.

Данные, приведенные на рис.1 и рис.2, доказывают установление причинно-следственной связи нарушения поствакцинального иммунитета к коклюшу от влияния таких токсикантов антропогенного происхождения, как хром и марганец, при указанном их количественном содержании (достоверно значимое снижение содержания JgG к возбудителю коклюша при увеличении в крови концентрации хрома (недействующий уровень - 0,004 мг/дм³; R²=0,76; р≤0,0001) (рис.1) и марганца (недействующий уровень - 0,011 мг/дм³; R²=0,80; p≤0,0001) (рис.2). Из всего спектра установленных вредных веществ-загрязнителей в крови ребенка, поступивших из среды обитания, именно эти два вещества оказывают влияние на снижение поствакцинального иммунитета к коклюшу.

Для доказательства того, что у детей из группы наблюдения, по сравнению с детьми из группы сравнения, снижен поствакцинальный иммунитет, было проведено изучение показателей системного иммунитета. При этом было установлено, что у детей, проживающих в условиях антропогенного загрязнения среды обитания, достоверно более низкое, относительно группы сравнения, абсолютное содержание лимфоцитов СД19+ и CD16+56+ (р=0,01-0,001) и сывороточного иммуноглобулина А (р=0,02) (табл.4). Данные, приведенные в табл.4, показывают, что у детей группы наблюдения по сравнению с детьми группы сравнения достоверно на 30% ниже содержание антителопродуцирующих клеток (СД19+) (р≤0,01), в 1,8 раза выше содержание клеток-киллеров (CD16+56+) (р≤0,001) и более чем на 10% ниже уровень иммуноглобулина А (р≤0,02). Эти показатели как раз и характеризуют снижение о поствакцинального иммунитета.

Предлагаемый способ позволяет оценить влияние неблагоприятных химических факторов антропогенного происхождения на адекватность поствакцинального иммунитета к коклюшу, с целью выявления контингента детей, в отношении которых необходимо осуществление дополнительных мероприятий, направленных на повышение эффективности вакцинопрофилактики. При этом рекомендуется диспансерное наблюдение таких детей у аллерголога-иммунолога с проведением специализированных программ, например, контроль уровня поствакцинального иммунитета - 2 раза в год, иммунограмма - 2 раза в год, разработка индивидуальных программ вакцинопрофилактики.