СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ БЕНЗОЛА И ФЕНОЛА, ПОСТУПАЮЩИХ С АТМОСФЕРНЫМ ВОЗДУХОМ, НА НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИЙ ГЛУТАТИОНОВОЙ СИСТЕМЫ ДЕТСКОГО ОРГАНИЗМА

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики негативного воздействия ароматических углеводородов (бензола и фенола) на нарушение антиоксидантной и конъюгационно-элиминационной функций глутатионовой системы у детей, проживающих на территории, характеризующейся повышенным содержанием указанных соединений в атмосферном воздухе. Данный способ может быть использован для раннего выявления нарушений процессов биотрансформации ароматических углеводородов в организме детей, а также для повышения эффективности комплекса профилактических мероприятий, направленных на снижение вредного воздействия бензола и фенола на глутатионовую систему.

Бензол и его ближайший гомолог фенол являются представителями класса ароматических углеводородов и относятся к высокоопасным и умеренно опасным химическим веществам. Характерной особенностью данных соединений является значительная распространенность бензола и фенола в атмосферном воздухе населенных мест и их высокая повреждающая способность при поступлении в организм за счет образования в процессе биотрансформации агрессивных метаболитов.

Основной путь поступления бензола и фенола в организм - ингаляционный. При этом необходимо учитывать, что бензол является истинным ксенобиотиком и идентифицируется в биосредах организма только при экзогенном поступлении. Фенол, помимо экзогенного поступления в организм, способен образовываться эндогенно в качестве первичного метаболита в ходе биотрансформации бензола.

Под биотрансформацией понимают энзиматическое превращение жирорастворимых экзогенных или эндогенных соединений в полярные водорастворимые метаболиты, легко выводимые из организма. Биотрансформация, как правило, приводит к снижению активности токсикантов - дезактивации. Однако в некоторых случаях метаболиты химических веществ становятся более токсичными соединениями, могут изменить характер повреждающего действия или инициировать другой токсический процесс.

Например, биотрансформация бензола осуществляется в две фазы:

I фаза - модификация бензола в более полярное и гидрофильное соединение, чем исходное вещество, за счет включения в молекулу гидроксильной группы и образования первичного метаболита - фенола. Биотрансформация бензола:

Реакции I фазы осуществляются различными ферментными системами, локализованными в большей степени в клетках печени.

II фаза - биологическая конъюгация фенола с эндогенными молекулами, такими как глутатион, в результате образуется полярное соединение, хорошо растворимое в воде, фенилсульфат, легко выводимый почками и желчью из организма.

Качественные или количественные изменения функций основных составляющих компонентов системы биотрансформации неизменно ведут к нарушению процессов метаболизма и, как следствие, к накоплению токсичных соединений.

В связи с этим исследование нарушений функционирования глутатионовой системы, обеспечивающей физиологический тип биотрансформации бензола, с обоснованием показателей оценки нарушений антиоксидантной, конъюгационной и элиминационной функций является актуальным для задач расширения доказательной базы причинно-следственных связей «среда - здоровье», ранней диагностики и профилактики нарушения процессов метаболизма у детей как наиболее восприимчивой к токсическому воздействию категории населения.

Известно исследование состояния глутатионовой системы при воздействии фенола, формальдегида и гамма-излучения (диссертация «Глутатионовая система при воздействии фенола, формальдегида и гамма-излучения. Возможности коррекции витаминами А, Е и пантенолом», автор Петушок Н.Э., специальность ВАК 03.00.04 - Биохимия, http://www.referun.com/n/glutationovaya-sistema-pri-vozdeystvii-fenola-formaldegida-i-gamma-izlucheniya-vozmozhnosti-korrektsii-vitaminami-a-e-i-p). Данная работа касается изучения функции глутатионовой системы при воздействии фенола и формальдегида у крыс.

Однако в указанном источнике информации не затрагиваются моменты изучения конъюгационно-элиминационной функции глутатионовой системы, нарушение которой может привести к токсическому действию бензола и фенола на детский организм, развитие метаболических изменений, а также не устанавливаются причинно-следственные связи нарушения функций глутатионовой системы при воздействии бензола и фенола, поступающих с атмосферным воздухом.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении возможности на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать нарушение функционирования глутатионовой системы, обеспечивающей физиологический тип биотрансформации бензола, фенола, и производить оценку нарушений антиоксидантной, конъюгационно-элиминационной функций глутатионовой системы в организме, с последующим изменением процессов метаболизма у детей, ассоциированных с внешнесредовым воздействием бензола и фенола.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом оценки негативного воздействия бензола и фенола, поступающих с атмосферным воздухом, на нарушение функций глутатионовой системы детского организма, характеризующимся тем, что производят отбор пробы крови, определяют в цельной крови содержание ароматических соединений бензола и фенола, поступающих с атмосферным воздухом, а также определяют в сыворотке крови активность следующих лабораторных показателей: супероксиддисмутаза, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, далее устанавливают корреляционную зависимость между содержанием ароматических соединений и указанными лабораторными показателями, и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенное содержание бензола и/или фенола - повышенная активность глутатионпероксидазы, глутатиоредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и пониженная активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатион-S-трансферазы, судят о негативном воздействии бензола и фенола, поступивших с атмосферным воздухом, на функционирование глутатионовой системы детского организма.

Определение содержания ароматических соединений в крови осуществляют газохроматографическим методом количественного определения.

Технический результат, достигаемый заявляемым изобретением, обеспечивается за счет следующего.

Благодаря тому, что при реализации предлагаемого способа используются лабораторные показатели антиоксидантной и конъюгационно-элиминационной функций процессов, повышаются информативность способа и его достоверность.

Следует пояснить, что основными ферментами, реализующими антиоксидантную функцию глутатионовой системы в виде связывания образующихся гидроперекисей на уровне клетки, являются медь/цинк зависимая супероксиддисмутаза (далее Cu/Zn-СОД), каталаза и глутатионпероксидаза (далее ГлПО). Cu/Zn-СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и кислорода и таким образом участвует в регуляции свободорадикальных процессов в клетках на начальной стадии. В результате реакции дисмутации происходит увеличение в клетке концентрации перекиси водорода, которая оказывает повреждающее действие на клеточные компоненты. Каталаза активно включается в метаболизм перекиси, нейтрализуя ее до воды, тем самым препятствует накоплению данного соединения в клетках. Глутатионпероксидаза предупреждает возникновение и развитие пероксидации в клетке, т.е. катализирует разложение перекиси водорода и других гидроперекисей посредством окисления.

Основными ферментами глутатионовой системы, отвечающими за конъюгационно-элиминационную функцию, являются глутатионредуктаза, глутатион-S-трансфераза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Глутатионредуктаза катализирует реакцию восстановления глутатиона из окисленной его формы GS-SG. Глутатионредуктаза действует в паре с глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой - ферментом, необходимым для восстановления окисленного глутатиона. При этом в качестве донора водорода используется NADFH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции. Основная функция глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - поддержание восстановленной формы глутатиона, необходимого для осуществления конъюгации молекулы глутатиона с токсичными соединениями, в том числе с бензолом и фенолом.

Глутатион-S-трансфераза входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их конъюгации с восстановленным глутатионом. Основная функция глутатион-S-трансферазы - защита клеток от токсичных химических веществ и продуктов перекисного окисления липидов посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп.

Таким образом, в ходе второй фазы биотрансформации ферменты глутатионовой системы значительно ускоряют процесс конъюгирования метаболита токсиканта и последующую его элиминацию из организма.

Благодаря тому, что в предлагаемом способе в качестве лабораторных характеристик используют совокупность показателей, характеризующие антиоксидантную и конъюгационно-элиминационную функции глутатионовой системы с использованием корреляционного анализа, обеспечивается информационная связь лабораторных показателей с содержанием ароматический соединений (бензола, фенола) в крови, что делает способ более информативным и достоверным, за счет комплексной характеристики патологического процесса, обусловленного действием исследуемых химических соединений на развитие нарушений функционирования глутатионовой системы у детей, проживающих в условиях внешнесредовой экспозиции ароматических углеводородов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать нарушение функционирования глутатионовой системы с последующим изменением процессов метаболизма у детей.

Все это позволит повысить эффективность планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению негативного воздействия ароматических углеводородов, поступающих в организм с атмосферным воздухом, в частности бензол, фенол, обуславливающих нарушение функций глутатионовой системы у детей.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, реализуя его на конкретном примере:

- выбирают экологически неблагополучную территорию (г.Губаха Пермского края), характеризующуюся повышенным содержанием бензола и фенола в атмосферном воздухе;

- отбирают случайным образом группу детей (группа наблюдения), проживающих на этой территории. Было отобрано 403 ребенка в возрасте 3-7 лет из организованных коллективов и проживающих на исследуемой территории. В обследовании принимали участие дети, прошедшие утренний фильтр, следовательно, без клинических проявлений заболеваний;

- для проведения сравнительного анализа была обследована группа детей в количестве 102 человека аналогичного возраста, проживающих в условиях отсутствия экспозиции бензола и фенола (группа сравнения);

- у детей из указанных групп проводят отбор венозной цельной крови в две пробирки. Одну пробирку используют для определения содержания ароматических углеводородов в цельной крови. Вторую пробирку - для получения сыворотки крови;

- в цельной крови определяют содержание ароматических углеводородов (бензола и фенола), например, газохроматографическим методом количественного определения на хроматографе Хроматэк-Кристалл 5000.2, используя Методические указания МУК 4.1.765-99 «Газохроматографический метод количественного определения ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-, м-, п-ксилол) углеводородов в биосредах (кровь)»;

- в сыворотке крови традиционными методами (В.В.Меньшиков, 2003; B.C.Камышников, 2004; В.А.Ткачук, 2008) определяют следующие лабораторные показатели, имеющие отношение к антиоксидантным процессам, а именно активность супероксиддисмутазы (Cu/Zn-СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГлПО); и имеющие отношение к конъюгационно-элиминационным процессам - активность глутатионредуктазы, глутатион-S-трансферазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;

- далее проводят анализ причинно-следственных связей между воздействием токсичного вещества и ответной реакцией организма, характеризующей нарушение функций глутатионовой системы с использованием модели логистической регрессии, согласно которой рассчитывают вероятность негативного изменения маркера ответа организма (вышеуказанные лабораторные показатели) при воздействии на организм маркера экспозиции (бензол, фенол, поступающие с атмосферным воздухом). Проверка статистических гипотез относительно полученных корреляционных зависимостей проводится с использованием критерия Стьюдента. Различия считают статистически значимыми при вероятности p<0,05.

Результаты химико-аналитического обследования детей группы наблюдения показали, что в крови идентифицированы бензол в концентрации 0,002-0,028^* мг/дм³ (в 20% случаев от общего числа обследованных) и фенол в концентрации 0,01-0,33 мг/дм³ (в 70% случаев) (фоновый уровень в крови фенола 0,010±0,005 мг/дм³, нпо^* - ниже предела обнаружения: нпо бензола - 0,0035 мг/дм³). В крови детей группы сравнения бензол не идентифицирован. Установлено, что в крови детей группы наблюдения средняя концентрация фенола составила 0,118±0,031 мг/дм³ и в 10 раз превысила данный показатель в крови детей группы сравнения (0,011±0,008 мг/дм³; p=0,004). Таким образом, полученные результаты химико-аналитического контроля свидетельствуют об идентификации бензола и повышенном содержании фенола в крови у детей группы наблюдения, что может быть связано с нарушением процессов метаболизма бензола, последующего связывания и элиминации фенола из организма.

В ходе скринингового обследования детей группы наблюдения установлено достоверное изменение комплекса внутриклеточных ферментов I фазы биотрансформации бензола, свидетельствующее о напряжении, переходящем в стадию истощения, антиоксидантной функции глутатионовой системы. У детей в группе наблюдения установлено достоверное превышение среднего значения активности глутатионпероксидазы (40,84±4,15 нг/см³) относительно средней активности фермента в группе сравнения (кратность превышения составила 1,3 раза, р=0,000). При этом частота регистрации проб с повышенной активностью глутатионпероксидазы (17% случаев от общего количества обследованных детей) в 4 раза превысила показатель в группе сравнения. У детей группы наблюдения среднее значение активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови зарегистрировано на уровне 35,62±2,07 нг/см³, что в 2 раза ниже данного показателя у детей группы сравнения (р=0,000). При этом частота проб с пониженной активностью данного фермента в сыворотке крови обследуемой группы детей составила 70% случаев, в то время как в группе сравнения проб с пониженной активностью супероксиддисмутазы не установлено. У детей в группе наблюдения установлена пониженная активность каталазы в эритроцитах крови в 81% случаев от общего количества обследованных детей, что в 12 раз превысило частоту регистрации пониженного значения данного в группе сравнения (6%).

У обследованных детей наблюдается разнонаправленный характер изменений активности ферментов глутатионовой системы II фазы биотрансформации бензола. У детей группы наблюдения средняя активность глутатионредуктазы сыворотки крови составила 80,55±3,09 Е/дм³, что почти в 2 раза превысило данный показатель в группе сравнения (р=0,007).

Доля проб с повышенной активностью глутатионредуктазы у детей группы наблюдения составила 35% от общего количества обследованных, со средним значением показателя в этих пробах 104±2,02 Е/дм³, что достоверно ниже частоты регистрации повышенной активности данного фермента у детей группы сравнения (р=0,000). Зарегистрирована повышенная активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови детей группы наблюдения в 60% проб, что в 7 раз превысило данный показатель в группе сравнения. Среднее значение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в пробах с повышенной активностью составило 7,8±0,22 Е/дм³, что в 2 раза выше верхней границы возрастного физиологического уровня (р=0,000). Отмечается снижение активности глутатион-8-трансферазы у детей группы наблюдения 79,04±15,86 нг/см³ в 1,4 раза относительно физиологической нормы и в 2,5 раза относительно показателя у детей группы сравнения, что свидетельствует об относительно низкой конъюгации с активными продуктами метаболизма бензола.

Таким образом, результаты выполненных исследований позволили установить напряжение активности, переходящее в стадию истощения, комплекса внутриклеточных ферментов антиоксидантной функции глутатионовой системы I фазы биотрансформации. Также было установлено повышение активности ферментов, обеспечивающих восстановление окисленного глутатиона и энергетическое сопровождение данного процесса, необходимого для связывания образующихся метаболитов. Выявлено снижение активности ферментов, необходимых для реализации функции конъюгации метаболитов и их элиминации в ходе II фазы биотрансформации.

В результате математического моделирования выявлена зависимость изменения показателей функций глутатионовой системы в I и II фазы биотрансформации от содержания в крови бензола и фенола. Данные исследований приведены в таблице.

О напряженном состоянии антиоксидантной функции глутатионовой системы у обследованных детей, переходящем в стадию истощения, свидетельствует изменение активности основных ферментов I фазы биотрансформации при повышенном содержании в крови бензола и фенола. У детей группы наблюдения установлена прямая связь между активностью ГлПО и содержанием в крови бензола и фенола. Доказана достоверная причинно-следственная связь вероятности понижения активности Cu/Zn-СОД и каталазы при повышенном содержании в крови бензола и фенола, а также между активностью Cu/Zn-СОД и повышенным уровнем фенола в крови детей группы наблюдения.

На нарушение конъюгационно-элиминационной функции глутатионовой системы у обследованных детей указывает характер изменений активности ферментов II фазы биотрансформации. У детей группы наблюдения установлена достоверная причинно-следственная связь вероятности повышения активности ферментов, участвующих в поддержании восстановленной формы глутатиона для реакции биохимического конъюгирования, - глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови, при повышенном уровне в крови бензола и фенола. Выявлена обратная причинно-следственная связь вероятности снижения активности глутатион-S-трансферазы при повышенном уровне в крови бензола и фенола, что свидетельствует о возможном снижении активности процесса конъюгации фенола с восстановленным глутатионом и его последующей элиминации.

После обследования детей предлагаемым способом было установлено, что у 209 из 403 детей имеется риск развития экологически обусловленных заболеваний, ассоциированных с токсическим действием бензола и фенола на организм, т.к. у этих 209 детей установлена достоверная зависимость: превышение в крови концентрации бензола и фенола при одновременном повышении в крови по сравнению с нормой активности глутатионпероксидазы, глутатиоредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и снижение активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатион-S-трансферазы.

Для доказательства такого вывода, из указанных 209 детей через 6 месяцев был проведен анализ заболеваемости. Из этих детей у 29 было выявлено увеличение размеров печени по результатам УЗИ, у 33 - билиарные дисфункции, у остальных - частая анемия, связанная с воздействием внешних агентов, заболевания иммунной системы в виде персистирующего транзиторного иммунодефицита. Согласно токсикологическим свойствам бензола и фенола, все указанные болезни обусловлены воздействием их повышенного содержания в крови.

Такому же анализу подверглась заболеваемость 25 детей из этой же группы, у которых в крови было установлено повышенное содержание бензола и фенола, но без установления (т.е. без подтверждения) корреляционной зависимости между уровнем содержания ароматических соединений в крови и лабораторными показателями функций глутатионовой системы. Определено, что у 12 детей установлена билиарная дисфункция, у 4 детей - анемия, у 7 детей заболевания иммунной системы в виде персистирующего транзиторного иммунодефицита, у остальных детей клинической манифестации заболеваний не установлено.

Анализ заболеваемости 13 детей с уровнем исследуемых ароматических соединений в крови ниже предела обнаружения показал, что у 5 детей зарегистрировано по 1 случаю билиарной дисфункции, у 2 - персистирующий транзиторный иммунодефицит, у остальных детей клинической манифестации заболеваний не установлено.

Вышеуказанные данные являются доказательством того, что только при наличии предложенной взаимосвязи содержания бензола и фенола в крови и уровнем заявленных лабораторных показателей, характеризующих антиоксидантную и конъюгационно-элиминационную функции глутатионовой системы, обеспечиваются точность, достоверность и информативность предлагаемого способа, посредством которого можно определить процесс конъюгирования токсиканта и последующую его элиминацию из организма, а также нарушение метаболических процессов в организме.

Таким образом, использование предлагаемого способа при обследовании детей, проживающих в условиях внешнесредовой экспозиции бензола и фенола, позволяет:

- обеспечить возможность выявления с высокой точностью на ранней стадии нарушение функций глутатионовой системы при действии бензола и фенола;

- обеспечить прогноз возникновения и характера течения заболеваний различных нозологий, сопряженных с нарушением антиоксидантной и конъюгационно-элиминационной функции глутатионовой системы;

- обосновать необходимость углубленного клинического обследования ребенка именно в отношении заболеваний, характерных для повышенного содержания ароматических соединений.