Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ФОРМАЛЬДЕГИДА, ПОСТУПАЮЩЕГО С АТМОСФЕРНЫМ ВОЗДУХОМ, НА НАРУШЕНИЕ КОНЪЮГАЦИОННОЙ И ЭЛИМИНАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ГЛУТАТИОНОВОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики негативного воздействия формальдегида на нарушение конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы у детей, проживающих на территории, характеризующейся повышенным содержанием данного соединения в атмосферном воздухе. Предлагаемый способ может быть использован для ранней диагностики нарушения конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы у детей, ассоциированной с внешнесредовой экспозицией формальдегида, и для повышения эффективности комплекса профилактических мероприятий, направленных на восстановление функции глутатионовой системы, обеспечивающей конъюгацию, связывание и выведение конечных метаболитов из организма.

Формальдегид относится к наиболее распространенным химическим продуктам, поступающим в атмосферный воздух с выбросами предприятий химической, деревообрабатывающей, целлюлозно-бумажной промышленности, органического синтеза. По степени опасности воздействия на организм формальдегид относится к высоко опасным химическим веществам (2 класс опасности). При внешнесредовой экспозиции формальдегида возникают негативные эффекты:

- угнетение тканевого дыхания в результате нарушения окислительного фосфорилирования, следствием чего является торможение анаэробного гликолиза и развитие недостатка АТФ;

- подавление активности SH-энзимов;

- угнетение синтеза нуклеиновых кислот;

- нарушение обмена аскорбиновой кислоты;

- нарушение антигенной стимуляции иммунной системы.

Основным путем поступления формальдегида в организм является ингаляционный. Формальдегид через легкие поступает в кровоток и распределяется по организму, преимущественно, аккумулируясь в костном мозге. До 40% формальдегида выделяется из организма с выдыхаемым воздухом, почками, но большая его часть подвергается биотрансформации, которая осуществляется, в основном, в печени. В процессе биотрансформации происходит окисление формальдегида через промежуточные продукты S-гидроксиметил и S-формилглутатион, с образованием конечных метаболитов - метанола и муравьиной кислоты. Схематическое изображение биотрансформации формальдегида представлено ниже.

Всю последовательность реакции биотрансформации формальдегида можно разделить на две основные фазы:

- первая фаза биотрансформации - химическая модификация формальдегида, связанная с приданием токсическому соединению гидрофильных свойств, которые облегчают его экскрецию из организма. К ферментам первой фазы биотрансформации относят цитохромы Р-450, флавинсодержащие монооксигеназы, эстеразы и др., которые участвуют в реакциях окисления и восстановления молекул;

- вторая фаза биотрансформации - ковалентная конъюгация, ведущая к образованию транспортных форм токсичных соединений и способствующая их выведению из организма. К ферментам второй фазы биотрансформации относят глутатионпероксидазу, защищающую от окислительного повреждения восстановленный глутатион, необходимый в эндогенном связывании промежуточного метаболита; глутатион-S-трансферазу, катализирующую присоединение глутатиона к эндогенно образованному промежуточному метаболиту; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, обеспечивающую поддержание уровня восстановленного глутатиона.

Ферменты глутатионовой системы являются одними из основных составляющих, обеспечивающих связывание и выведение промежуточных и конечных метаболитов при биотрансформации формальдегида.

Конъюгация - реакция синтеза чужеродного вещества с эндогенными молекулами или их группировками (аминокислоты, глюкуроновая или серная кислоты и др.), в результате чего образуются конъюгаты - более полярные, гидрофильные соединения, легко выводимые из организма.

Элиминация - удаление чужеродного вещества из организма, состоящее из двух процессов: нейтрализации путем биотрансформации и собственно экскреции.

Качественные или количественные изменения конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы неизменно ведут к нарушению процесса метаболизма и, как следствие, к накоплению формальдегида в организме.

В связи с этим, исследование и оценка конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы являются актуальными для расширения доказательной базы причинно-следственных связей в системе «среда - здоровье населения», ранней диагностики и профилактики нарушения процессов метаболизма у детей, как наиболее восприимчивой субпопуляции к хроническому внешнесредовому воздействию химических факторов вследствие онтогенетического несовершенства организма в данный возрастной период.

Известно исследование состояния глутатионовой системы при воздействии фенола, формальдегида и гамма-излучения (диссертация «Глутатионовая система при воздействии фенола, формальдегида и гамма-излучения. Возможности коррекции витаминами А, Е и пантенолом», автор Петушок Н.Э., специальность ВАК 03.00.04 - Биохимия, http://www.referun.com/n/glutationovaya-sistema-pri-vozdeystvii-fenola-formaldegida-i-gamma-izlucheniya-vozmozhnosti-korrektsii-vitaminami-a-e-i-p.). Данная диссертация касается изучения функции глутатионовой системы при воздействии фенола и формальдегида у крыс.

Однако в указанном источнике информации не затрагиваются моменты изучения конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы, нарушение которой может привести к токсическому действию формальдегида на детский организм, на развитие метаболических изменений, а также не обеспечивает установление причинно-следственных связей нарушения функций глутатионовой системы при воздействии формальдегида, поступающего с атмосферным воздухом.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении возможности на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать нарушение конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы, обеспечивающей связывание и выведение конечных метаболитов при биотрансформации формальдегида, поступившего в детский организм с атмосферным воздухом.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом оценки негативного воздействия формальдегида, поступающего с атмосферным воздухом, на нарушение конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы у детей, характеризующимся тем, что производят отбор пробы крови, определяют в цельной крови содержание формальдегида, поступающего с атмосферным воздухом, а также определяют в сыворотке крови активность следующих лабораторных показателей: глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, далее устанавливают корреляционную зависимость между содержанием формальдегида и указанными лабораторными показателями, и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенное содержание формальдегида - пониженная активность глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышенная активность глутатион-S-трансферразы, судят о негативном воздействии формальдегида на осуществление конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы детского организма.

Технический результат, достигаемый заявляемым техническим решением, обеспечивается за счет следующего.

Благодаря тому что при реализации предлагаемого способа используются лабораторные показатели конъюгационной и элиминационной функций процессов, повышается информативность способа и его достоверность.

Основным ферментом глутатионовой системы, отвечающим за конъюгацию и элиминацию конечных метаболитов, является глутатион-S-трансфераза. Данный фермент способствует присоединению к субстрату молекулы глутатиона для перевода промежуточных метаболитов в траспортные формы, легко выводимые из организма.

Глутатионпероксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - ферменты глутатионовой системы, необходимые для нормального функционирования глутатиона.

Таким образом, ферменты глутатионовой системы значительно ускоряют процесс конъюгирования метаболита токсиканта и последующую его элиминацию из организма.

Благодаря тому, что в предлагаемом способе в качестве лабораторных характеристик используют показатели, отражающие работу глутатионовой системы с использованием корреляционного анализа, обеспечивается информационная связь активности ферментов с содержанием формальдегида в крови, что делает способ более информативным и достоверным.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать нарушение конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы с последующим изменением процессов метаболизма у детей.

Все это позволит повысить эффективность профилактических мероприятий по предупреждению и устранению негативного хронического аэротехногенного воздействия формальдегида, обуславливающего нарушение конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы у детей.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, реализуя его на конкретном примере:

- выбирают экологически неблагополучную модельную территорию (п.Гамово, п.Кондратово Пермского района), характеризующуюся повышенным содержанием формальдегида в атмосферном воздухе;

- отбирают случайным образом группу детей (группа наблюдения), проживающих на этой территории. Было отобрано 87 детей в возрасте 3-6 лет из дошкольных организованных коллективов, проживающих на исследуемой территории. В обследовании принимали участие дети, прошедшие утренний фильтр, следовательно, без клинических проявлений заболеваний;

- для проведения сравнительного анализа обследована группа детей в количестве 72 человек аналогичного возраста, проживающих в условиях отсутствия экспозиции формальдегида (группа сравнения);

- у детей из указанных групп проводят отбор венозной цельной крови в две пробирки. Одну пробирку используют для определения содержания формальдегида в цельной крови. Вторую пробирку - для получения сыворотки крови;

- в цельной крови определяют содержание формальдегида, например, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии согласно Методическим указаниям МУК 4.1.2111-06 «Измерение массовой концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида и ацетона в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко от 9 августа 2006 г.);

- в сыворотке крови традиционными методами определяют лабораторные показатели: активность глутатион-S-трансферазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;

- затем проводят анализ причинно-следственных связей между воздействием формальдегида и ответной реакцией организма, характеризующей нарушение конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы, с использованием модели логистической регрессии, согласно которой рассчитывают вероятность негативного изменения маркера ответа организма (вышеуказанные лабораторные показатели) при воздействии на организм маркера экспозиции (формальдегида, поступающего с атмосферным воздухом). Проверка статистических гипотез относительно полученных корреляционных зависимостей проводится с использованием критерия Стьюдента. Различия считают статистически значимыми при вероятности р<0,05.

Химико-аналитическое исследование крови у детей группы наблюдения показало, что средняя концентрация формальдегида составила 0,0102±0,001 мг/дм³, что в 2 раза превысило аналогичный показатель у детей в группе сравнения (р=0,000). При этом в группе наблюдения установлено до 50% случаев с повышенным содержанием формальдегида в крови.

Изучение и оценка состояния функций глутатионовой системы у детей, проживающих в условиях экспозиции формальдегида, показали разнонаправленный характер изменения активности ферментов. Так, у детей группы наблюдения установлено снижение активности глутатионпероксидазы (25,9±1,88 нг/см³) в сыворотке крови в 1,2-2 раза относительно физиологической нормы и группы сравнения соответственно (р=0,003-0,049). Несмотря на то, что среднее значение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (3,01±0,19 Е/дм³) установлено в пределах физиологической нормы, при этом зафиксировано достоверное снижение в 1,4 раза значение данного показателя относительно активности фермента в группе сравнения (р=0,032). Частота регистрации проб с отклонением активности ферментов глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, обеспечивающих защиту эндогенной молекулы восстановленного глутатиона от окислительного повреждения, от физиологической нормы у детей в группе наблюдения составила соответственно 68% и 10% случаев, что практически в 10 раз превысило результаты исследований данных показателей у детей группы сравнения.

Несмотря на то, что среднее значение активности глутатион-S-трансферазы (206,2±16,92 нг/см³) в сыворотке крови детей группы наблюдения установлено в пределах физиологической нормы, при этом зарегистрировано достоверное повышение аналогичного показателя в 1,4 раза относительно активности данного фермента у детей вне экспозиции формальдегида. У детей в группе наблюдения зарегистрировано до 15% случаев превышения активности фермента глутатион-S-трансферазы, катализирующей присоединение глутатиона к эндогенно образованным метаболитам, при отсутствии таковых в группе сравнения.

Таким образом, результаты выполненных исследований позволили установить снижение активности ферментов, обеспечивающих поддержание восстановленного глутатиона и повышение активности фермента, необходимого для связывания образующихся метаболитов.

У детей группы наблюдения установлена достоверная зависимость вероятности изменения активности ферментов глутатионовой системы при повышенном содержании формальдегида в крови. Данные приведены в таблице.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что установлена обратная зависимость снижения активности глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при повышенном содержании в крови формальдегида (R²=0,21-0,25; 6,13≤F≥12,39; p=0,007-0,014). Полученные результаты свидетельствуют, что при избыточном содержании формальдегида в организме возможно окислительное повреждение глутатиона, необходимого при эндогенном связывании и выведении конечных метаболитов. При этом установлена прямая причинно-следственная связь вероятности увеличения активности глутатион-S-трансферазы с повышенным содержанием в крови формальдегида (долевой вклад химического фактора составил 16%; р=0,032). Подобные связи у детей, проживающих в условиях отсутствия внешнесредового аэрогенного поступления формальдегида, не выявлены.

После обследования детей группы наблюдения предлагаемым способом было установлено, что у 37 из 87 детей имеется риск развития экологически обусловленных заболеваний, ассоциированных с токсическим действием формальдегида на организм, т.к. у этих 37 детей установлена достоверная зависимость: превышение в крови концентрации формальдегида при одновременном снижении в крови по сравнению с нормой активности глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышение активности глутатион-S-трансферазы.

Для доказательства такого вывода, из указанных 37 детей (у которых выявлены одновременно достоверные зависимости: повышенное содержание формальдегида в крови - пониженная активность глутатионпероксидазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; повышенная активность глутатион-S-трансферазы) через 6 месяцев был проведен анализ заболеваемости. Выполненные исследования показали, что из этих детей у 9 установлен аллергический ринит, у 7 - бронхиальная астма, у остальных - заболевания иммунной системы в виде персистирующего транзиторного иммунодефицита. Согласно токсикологическим свойствам формальдегида, все указанные болезни обусловлены воздействием его повышенного содержания в крови.

Такому же анализу подверглась заболеваемость 19 детей из этой же группы, у которых в крови было установлено повышенное содержание формальдегида, но без установления (т.е. без подтверждения) корреляционной зависимости между уровнем данного соединения в крови и лабораторными показателями конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы. Установлено, что у 5 детей установлен аллергический ринит, у 2 детей - бронхиальная астма, у 3 детей -заболевания иммунной системы в виде персистирующего транзиторного иммунодефицита, у 9 детей заболеваний, сопряженных с токсическим действием формальдегида, не установлено.

Анализ заболеваемости 11 детей с уровнем формальдегида в крови ниже предела обнаружения показал, что у 3 детей зарегистрирован аллергический ринит, по 1 случаю бронхиальной астмы, у 1 - персистирующий транзиторный иммунодефицит, у 6 детей заболеваний, сопряженных с токсическим действием формальдегида, не установлено.

Вышеуказанные данные являются доказательством того, что только при наличии предложенной взаимосвязи содержания формальдегида в крови и уровня заявленных лабораторных показателей обеспечивается точность, достоверность и информативность предлагаемого способа, посредством которого можно определить процесс конъюгирования токсиканта и последующую его элиминацию из организма.

Таким образом, использование предлагаемого способа при обследовании детей, проживающих в условиях внешнесредовой экспозиции формальдегида, позволяет:

- обеспечить возможность выявления с высокой точностью на ранней стадии нарушения конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы при действии формальдегида;

- обеспечить прогноз возникновения и характера течения заболеваний различных нозологии, сопряженных с нарушением конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы;

- обосновать необходимость углубленного клинического обследования ребенка именно в отношении заболеваний, характерных для повышенного содержания формальдегида в крови.