Результат интеллектуальной деятельности: ГЕЛЕОБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ШИРОКОГО СПЕКТРА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Изобретение относится к биологически активным препаратам и может быть использовано в медицине, а именно в стоматологии, гинекологии и ларингологии, а также в фармацевтической, пищевой промышленности, ветеринарии, косметологии и биотехнологии.

Известно, что хитозан - производное биополимера хитина - обладает ценным комплексом физико-химических и биологических свойств. Нетоксичность, особенности химической структуры (наличие в элементарных звеньях макромолекулы групп -ОН, -NH₂ и -NHCOCH₃), возможность варьирования содержания аминогрупп и степени протонирования, широкий диапазон молекулярной массы() и др. обеспечивают широкий ассортимент образцов хитозана и материалов на его основе для решения целого ряда проблем в разных сферах жизни [Хитозан/Под ред. Р.А.А. Муццарелли. Пер. с англ. Л.С. Пачковской. Н. Новгород: Изд-во «Вектор-ТиС». 2001. 372 с.; Гальбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение //Соросовск.Образоват. журн. 2001. Т.7. №1. С.51-56; Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение /Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука. 2002. 368 с.; Немцев С. В. Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных. М.: Изд-во ВНИРО. 2006. 134 с.].Среди множества разновидностей препаратов на основе хитозана гели и гелеобразные формы имеют ряд преимуществ. Они обладают вязкой консистенцией, обеспечивают большую биодоступность, оказывают увлажняющее действие на кожу и по сравнению с мазями лучше всасываются. Их фармакотерапевтическое действие пролонгированное и более выраженное. Кроме того, в отличии от мазей при попадании на кожу или одежду они легко смываются водой, не оставляя никаких следов.

Известен способ получения биологически активного комплекса на основе лактата хитозана (экогель) и состав биологически активного комплекса для защиты сельскохозяйственных растений [см. патент РФ №2316963, МПК A01N59/00, A01N25/04, A61K31/722, A01N37/02]. Активный комплекс на основе лактата хитозана получают растворяя хитозан в водном растворе молочной кислоты при соотношении реагентов 1:1, температуре 65-75°С и фиксированном рН (6.5-7.0) при постоянном перемешивании с вихревым движением потока массы, при насыщении массы ионами серебра с последующей магнитной обработкой. При этом получают гель, прошедший магнитную обработку и содержащий в г/л: хитозан с СД=75-88 мольн.% −1.0-50.0 (0.1-5.0 мас.%), молочную кислоту − 1.0-50.0 (0.1-5.0 мас.%), ионы серебра - 7.5-10.0 мг/л и вода - остальное.

Недостатком данного активного комплекса на основе лактата хитозана является многокомпонентность, многостадийность получения, строгий контроль за температурой и рН, использование дорогостоящего препарата ионов серебра, а также дополнительного оборудования для магнитной обработки. Трудно представить на основании приведенных данных, что авторы имеют дело с «гелем», т.к. они не используют сшивающий агент. Кроме того известно, что эффект активации после обработки в магнитном поле сохраняется в течение непродолжительного времени (до одних суток) [Сокольский Ю.М. Омагниченная вода: правда и вымысел. Л.: Химия. 1990. 144 с.].

Известен «гель» для ухода за кожей и лечения ее заболеваний и композиция для его получения [см. патент РФ №2085187, МПК A61K7/48]. Данная композиция помимо хитозана, витаминного препарата и дистиллированной воды дополнительно содержит антисептик и анестетик.

Недостатком данного геля является сложность получения и содержание токсичных веществ (антисептик и анестетик), способных вызвать аллергические реакции, снижать иммунный статус и т.п.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по своей технической сущности является гелевая композиция на основе хитозана, обладающая ранозаживляющим, противоожоговым, противовоспалительным, гепатопротекторным, противодиабетическим и противоопухолевым действием [см. патент РФ №2366408, МПК A61K9/00, A61K31/519, A61K31/722, A61P1/16, A61P3/10, A61P17/02, A61P29/00, A61P35/00]. Заявляемая композиция помимо хитозана 15-25 г/л (1.5-2.5 мас.%) и дистиллированной воды содержит триптантрин 1.5-2.5 г/л (0.15-0.25 мас.%).

Недостатком гелевой композиции является многокомпонентность, многостадийность получения, использование таких органических растворителей, как уксусная кислота и диметилсульфоксид (данные компоненты не приведены в составе гелевой композиции в формуле изобретения). Для усиления биологической активности композиции потребовалось ввести дополнительный компонент - алкалоид триптантрин, действие которого на клетки человека до настоящего момента недостаточно изучено. Триптантрин плохо растворим в воде, для его введения в гелевую композицию используют раствор этого алкалоида в диметилсульфоксиде. Диметилсульфоксид противопоказан при ряде заболеваний печени, почек, стенокардии, катаракте, глаукоме, беременности и др.

Задача изобретения - создание гелеобразной композиции на основе низкомолекулярного (=38 кДа) гидрохлорида хитозана широкого спектра биологического действия: антибактериального, противовоспалительного, ранозаживляющего и косметического.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в снижении токсичности и расширении спектра биологического действия композиции за счет синергетического эффекта взаимодействия гидрохлорида хитозана и фармакопейной органической кислоты, выбранной из ряда: уксусная, аскорбиновая, гликолевая, молочная, лимонная и янтарная.

Поставленная задача решается тем, что гелеобразная композиция, содержащая активнодействующее вещество и дистиллированную воду, согласно решению в качестве активнодействующего вещества содержит гидрохлорид хитозана, композиция дополнительно содержит органическую кислоту, выбранную из ряда: уксусная, аскорбиновая, гликолевая, молочная, лимонная, янтарная; при следующем соотношении исходных компонентов, мас.%:

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 представлена структурная формула полимерной композиции.

На фиг. 2 представлена динамика процесса заживления раны у лабораторных животных.

Экспериментально установлено, что концентрация полимера (С_п) гидрохлорида хитозана, менее 10 мас.% не достаточна для получения гелеобразной консистенции, а более 20 мас.% в принятых условиях растворения не приводит к полному участию полимера в образовании гелеобразной композиции, что с фармакотерапевтической и экономической точки зрения нецелесообразно.

Концентрация органической кислоты (С_к) в композиции определялась опытным путем по значению рН до 3 с учетом вида биологического действия (например, ГОСТа РФ на «Гели косметические»).

Сопоставляя экспериментальные данные элементного анализа исходного образца и потенциометрического титрования водного, водно-кислотного (0.1 NHCl) растворов исходного образца и композиции гидрохлорида хитозана в водном растворе органической кислоты (например, аскорбиновой) можно заключить, что в гелеобразной композиции образуется двойная соль хитозана, которая помимо групп гидрохлорида включает, по меньшей мере, одну группу аскорбат ахитозана в составе макромолекулы (или противоиона другой кислоты).

Предполагаемая структурная формула полимерной композиции представлена на фиг. 1, где х - количество мономерных звеньев аскорбата хитозана, y - гидрохлорида хитозана, z -N-ацетил-D-глюкозамина.

Исследования показали повышение биологической активности и расширение спектра биологического действия заявляемой гелеобразной композиции.

Заявляемую гелеобразную композицию получают следующим образом.

Используют промышленный образец гидрохлорида хитозана (с=38кДа, СД=80±2 мольн.%), произведенный ЗАО «Биопрогресс». Навеску гидрохлорида хитозана растворяют в водном растворе уксусной, или аскорбиновой, или гликолевой, или молочной, или лимонной, или янтарной кислоты фиксированной концентрации при непрерывном перемешивании в течение 3 часов при температуре 20-22°С. Полученную гелеобразную (высоковязкую) систему выдерживают в статических условиях в течение одних суток. Затем композицию фильтруют через тканевый фильтр и фасуют в стерильные емкости. Все операции проводят с соблюдением санитарно-эпидемиологических требований. Гелеобразную композицию хранят в холодильной камере при температуре +4°-+6°С.

Для оценки цитотоксичности и мутагенного эффекта использовали микроядерный тест (МЯ-тест) и экспресс-метод оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия на культуре подвижных клеток (Методические рекомендации. МР №29ФЦ/394 Минздрав России. М., 2002).

Антибактериальное действие изучали на примере тестовых штаммов Escherichiacoli 113−13, или Staphylococcusaureus 209 P, или Bacilluscereus 8035 с использованием стерильных жидкой питательной среды - мясо-пептонного бульона (МПБ) и твердой питательной среды - мясо-пептонного агара (МПА).

Противовоспалительное действие оценивали на моделях in vitro (культура клеток) и in vivo (в клинической практике).

Ранозаживляющее действие образцов проводили invivo на животных моделях (белые мыши-самцы и беспородные крысы-самки). При работе с экспериментальными животными руководствуются приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. и требованиями Европейской конвенции по защите лабораторных животных. Все манипуляции с животными проводили под эфирным наркозом.

Косметическое действие оценивали на моделях in vivo − добровольцах с использованием опросных листов.

Все методики тестирования и испытаний приведены в конкретных примерах.

Применимость заявляемого решения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Оценка цитотоксичности и мутагенного эффекта.

Оценка цитотоксичности и мутагенного эффекта на примере гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора аскорбиновой кислоты. Гелеобразная композиция подвергается доклиническим токсикологическим исследованиям с использованием микроядерного теста (МЯ-тест) и экспресс-метода оценки общетоксического и кожно-раздражающего действия на культуре подвижных клеток (Методические рекомендации. МР №29ФЦ/394 Минздрав России. М., 2002). Результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Результаты определения острой токсичности образца гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора аскорбиновой кислоты на культуре подвижных клеток in vitro

Таблица 2

Результаты определения острой токсичности образца гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора аскорбиновой кислоты МЯ-методом

Как можно видеть из данных, приведенных в таблицах 1 и 2, по степени воздействия на здоровье человека исследуемый образец гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора аскорбиновой кислоты относится к 4 классу опасности (малоопасные, ГОСТ 12.1.007-76) и не оказывает мутагенный эффект на клетки человека.

Пример 2. Антибактериальное действие.

В отдельную пробирку со стерильным мясо-пептонным бульоном (МПБ) добавляется образец гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора органической кислоты (уксусной, аскорбиновой, гликолевой, молочной, лимонной, янтарной) в объемном соотношении 1:1 и тщательно перемешивается. После этого в каждый из полученных бульонных растворов образцов композиции солей хитозана вносится по 0.1 мл клеточной суспензии (10⁵ КОЕ/мл) тестовых штаммов Escherichiacoli 113−13 или Staphylococcusaureus 209 P или Bacilluscereus 8035. Пробирки помещаются в термостатируемую качалку и культивируются трое суток при 37°С. В качестве контроля используются взятые в тех же концентрациях суспензии тест-штаммов в МПБ без добавления образцов гелеобразной композиции. Антибактериальная активность оценивается через 24, 48 и 72 часа визуально по мутности раствора и путем высева содержимого пробирок (по 0.1 мл) на мясо-пептонный агар (МПА). Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Физико-химические характеристики и антибактериальная активность образцов гелеобразной композиции на основе комплекса солей хитозана

*Микроорганизмы: E.coli 113-13, S.aureus 209 P, B.cereus 8035;

«-» отсутствие роста штаммов микроорганизмов;

«+» наличие роста штаммов микроорганизмов.

Из приведенных в таблице 3 данных видно, что гелеобразная композиция на основе гидрохлорида хитозана и водного раствора органической кислоты (уксусной, аскорбиновой, гликолевой, молочной, лимонной, янтарной) проявляет пролонгированное антибактериальное действие по сравнению с водным раствором исходного полимера хитозана независимо в какой химической форме он находится, т.е. в виде полиоснования (-NH₂) или в виде полисоли (-NH₃ ⁺Cl^-). При этом экспериментально определили, что максимально растворимая в воде концентрация исходного полимера составляет 4 мас.%. Бόльшая концентрация как хитозана, так и гидрохлорида хитозана приводит к набуханию полимера.

Группа примеров 3-8. Противовоспалительное действие.

Противовоспалительное действие на примере гелеобразной композиции гидрохлорида хитозана в водном растворе аскорбиновой кислоты. Тестирование образцов проводится на моделях in vitro (культура клеток) и in vivo (в клинической практике).

Пример 3. В качестве тестовых моделей in vitro используется культура эпителиальных клеток МА-104 (НИИ цитологии РАН, г. Санкт-Петербург). Клетки выращиваются в атмосфере 5% СО₂ при 37ºС в питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) без антибиотиков. Клетки, достигшие монослоя, подвергаются ферментативной дезагрегации, отмываются в фосфатно-солевом буфере (PBS; Sigma, США), ресуспендируются в свежей среде и вносятся в чашки Петри до конечной концентрации 130-150 тыс. клеток в 1 мл среды ДМЕМ, не содержащей (отрицательный контроль) или содержащей стерильный образец гелеобразной композиции (7 мкл на 1 мл среды). Контроль за динамикой изменения концентрации цитокинов IL-1β, IL-8 и TNF-α в ростовых средах осуществляется методом твердофазного иммуноферментного анализа согласно инструкциям, прилагаемым к наборам реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, РФ).

Результаты определения продукции цитокинов культурой МА-104 в ответ на контакт с гелеобразной композицией приведены в таблице 4.

Таблица 4

Продукция цитокинов культурой эпителиальных клеток МА-104 в ростовой среде ДМЕМ с или без добавления гелеобразной композиции

Из данных таблицы 4 видно, что гелеобразная композиция на 1-е сутки снижает в 2 раза, а на 2-е сутки полностью подавляет секрецию цитокина ФНО-α, являющегося основным медиатором воспалительной реакции; усиливает продукцию цитокина ИЛ-8, обусловливающего миграцию клеток врожденного иммунитета в очаг воспаления; повышает продукцию цитокина ИЛ-1β, стимулирующего фагоцитарную активность микро- и макрофагов. Таким образом, в эксперименте in vitro на модели культуры эпителиальных клеток МА-104 выявляется противовоспалительное действие гелеобразной композиции за счет подавления продукции противовоспалительного цитокина ФНО-α и стимуляции эффекторных клеток врожденного иммунитета.

Пример 4. В клинической практике 15 пациентам, страдающим хроническим пародонтитом легкой степени тяжести, проводится 10-ти дневная традиционная комплексная терапия совместно с аппликацией гелеобразной композиции на область сосочков и краевой десны с захватом 1-2 см слизистой оболочки альвеолярного отростка и инстилляцией в пародонтальные карманы. Продолжительность ежедневных обработок 15 минут. Группу сравнения составляют 15 пациентов, получающих традиционную комплексную терапию без применения гелеобразной композиции. Клиническое состояние тканей пародонта оценивается с помощью индексов: гигиенического (ИГ), пародонтального (ПИ), папиллярно-маргинально-альвеолярного (РМА). Состояние костной ткани межзубных перегородок оценивается по данным внутриротовой рентгенографии. Противовоспалительное действие определяется как редукция индекса РМА по формуле:

ПЭ=100 × [РМА(1) - РМА(2)] /РМА(1), (%),

где ПЭ - противовоспалительная эффективность; индексы РМА(1) и (2) относятся к осмотру до и после терапии.

Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5

Индексная оценка состояния тканей пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом легкой степени до и после традиционной терапии без и с применением гелеобразной композиции

Из данных таблицы 5 видно, что при лечении больных хроническим пародонтитом легкой степени тяжести противовоспалительный эффект в 1.5 раза выше в случае проведения традиционной терапии в сочетании с ежедневными аппликациями гелеобразной композиции.

Пример 5. То же, что в примере 4, но при лечении пациентов с хроническим пародонтитом средней степени тяжести.

Таблица 6

Индексная оценка состояния тканей пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом средней степени до и после традиционной терапии без и с применением гелеобразной композиции

Из данных таблицы 6 видно, что при лечении больных хроническим пародонтитом средней степени тяжести противовоспалительный эффект оказался в 1.45 раза выше в случае проведения традиционной терапии в сочетании с ежедневными аппликациями гелеобразной композиции.

Пример 6. То же, что в примере 4, но при лечении больных хроническим катаральным гингивитом.

Таблица 7

Индексная оценка состояния тканей пародонта у пациентов с хроническим катаральным гингивитом до и после традиционной терапии без и с применением гелеобразной композиции

Из данных таблицы 7 видно, что при лечении больных хроническим катаральным гингивитом противовоспалительный эффект оказался в 1.3 раза выше в случае проведения традиционной терапии в сочетании с ежедневными аппликациями гелеобразной композиции.

Пример 7. Группе пациентов с обострением хронического гипертрофического фарингита (10 чел.) проводится традиционная терапия - двукратное прижигание лимфоидных гранул ротоглотки 10%-ным раствором нитрата серебра (ляписа) с интервалом один день. Во второй (опытной) группе больных хроническим гипертрофическим фарингитом (10 чел.) в течение 4 суток помимо традиционной терапии проводится ежедневная обработка глотки гелеобразной композицией (утром и вечером) в течение 30-60 сек. Гиперемия и степень инфильтрации гранул лимфоидной ткани ротоглотки оценивается по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) в баллах от 0 до 5. Выраженность болевого синдрома в горле (боль, ощущение першения, сухости, чувство инородного тела в горле) оценивается по ВАШ (0-10 баллов). При этом за 0 принимается отсутствие признака, а за 5 и 10 (соответственно) - максимальная его выраженность. Результаты применения гелеобразной композиции представлены в таблицах 8 и 9.

Таблица 8

Динамика изменения интенсивности болевых ощущений в горле при терапии хронического гипертрофического фарингита без и с применением гелеобразной композиции

Таблица 9

Динамика изменения выраженности гиперемии гранул лимфоидной ткани глотки при терапии хронического гипертрофического фарингита без и с применением гелеобразной композиции

На основании данных, приведенных в таблицах 8 и 9, можно утверждать, что применение гелеобразной композиции в сочетании с традиционной терапией хронического гипертрофического фарингита обеспечивает значительно более высокий анальгетический эффект и более выраженный регресс симптомов воспаления.

Пример 8. 15 женщинам, страдающим вагинальным дисбиозом, проводится традиционная терапия (метронидазол по 500 мг внутрь 2 раза в сутки в течение 7 сут.) в сочетании с обработкой слизистой оболочки влагалища гелеобразной композицией в количестве 1 мл 1 раз в 2 дня в течение 10 дней. Группу сравнения составляют 15 женщин, также страдающих вагинальным дисбиозом и получающих традиционное лечение, но без применения гелеобразной композиции. Эффективность противовоспалительного действия оценивается по жалобам пациентов и клинической картине. Результаты отражены в таблице 10.

Таблица 10

Динамика купирования симптомов вагинального дисбиоза в процессе проведения традиционной терапии без и с применением гелеобразной композиции

Результаты, представленные в таблице 10, свидетельствуют о высокой эффективности применения гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и раствора аскорбиновой в качестве противовоспалительного средства в комплексе с традиционной терапией вагинального дисбиоза.

Группа примеров 9-10. Ранозаживляющее действие.

Тестирование ранозаживляющего действия образцов гелеобразной композиции проводится in vivo на животных моделях. При работе с экспериментальными животными руководствуются приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. и требованиями Европейской конвенции по защите лабораторных животных. Все манипуляции с животными проводятся под эфирным наркозом.

Пример 9. Исследование ранозаживляющего действия гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и аскорбиновой кислоты проводится на модели половозрелых беспородных белых мышей-самцов со средней массой 18-20 г. Стандартная рана искусственно моделируется на депилированной поверхности спины путем резекции участка дермального слоя кожи площадью 1 см². В опытной группе животных (10 шт.) гелеобразная композиция равномерно наносится на обнаженную раневую поверхность. В контрольной группе (10 шт.) заживление раны происходит первичным натяжением без нанесения гелеобразной композиции. О течении раневого процесса судят по динамике уменьшения площади раны и по ее состоянию.

На фиг. 2 представлена динамика процесса заживления раны у лабораторных животных (белых мышей) при использовании гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и аскорбиновой кислоты (а-в) и в контроле (г-е): свежесформированная рана (а, г), состояние раны на 3-и (б, д) и 14-е сутки (в, е) эксперимента. Установлено, что при использовании гелеобразной композиции заживление раны происходит в среднем в 1.7-2 раза быстрее, чем в контроле.

Пример 10. Исследование ранозаживляющего действия гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и уксусной кислоты проводится на модели половозрелых беспородных крыс-самок со средней массой 300 г. Термические ожоги IIIБ степени средней площадью 9.8 мм² моделируются в межлопаточной области. Сформировавшийся на 3-й день струп и патологически измененные ткани удаляются методом острой некрэктомии. Контрольную группу животных (15 крыс) оставляют без лечения, остальным (15 крыс) на обнаженную раневую поверхность наносится гелеобразная композиция.

Установлено, что при использовании гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана в водном растворе уксусной кислоты наблюдается ускорение процесса заживления ожоговой раны IIIБ степени в среднем в 1.6 раза.

Пример 11. Косметическое действие.

На чистую кожу лица, шеи и рук легкими круговыми движениями наносится небольшое количество гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и раствора молочной, гликолевой или лимонной кислоты. Через 3-5 минут композиция смывается большим количеством теплой воды. Процедура повторяется не чаще 1-2 раза в неделю. Косметические эффекты, наблюдаемые при использовании гелеобразной композиции на основе солей хитозана, отражены в таблице 11.

Таблица 11

Косметическое действие гелеобразной композиции на основе гидрохлорида хитозана и органических кислот

Таким образом, использование низкомолекулярной соли хитозана - гидрохлорида хитозана в сочетании с различными органическими фармакопейными кислотами позволяет расширить спектр биологического действия и получить композицию, которая в зависимости от выбранной кислоты проявляет кроме антибактериальной активности, противовоспалительное, ранозаживляющее и косметическое. При этом полученная композиция не токсична, проста в получении, имеет низкую себестоимость и доступна для широкого круга потребителей.