СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЛАГАЛИЩА В ПРОЦЕССЕ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ НА ФОНЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологических материалов и может быть использовано для объективной оценки состояния слизистой влагалища в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований, в частности для оценки ранних лучевых реакций и повреждений слизистой влагалища при лучевой и химиолучевой терапии, формирующихся в процессе терапии или в ближайшие 3 месяца после нее. Такое ограничение установлено в соответствии с результатами радиобиологических исследований, показавших, что это крайний срок сублетального восстановления поврежденных клеток (Киселева Е.С. Лучевая терапия злокачественных опухолей. Рук. для врачей. М., 1996. 438 с).

Изобретение посвящено проблеме, актуальность которой возросла в последние десятилетия в связи с расширением использования в практике современных программ лучевой терапии. Использование нетрадиционных режимов фракционирования дозы, подведение высоких уровней суммарных очаговых доз неизбежно влечет за собой повышение токсических реакций со стороны нормальных тканей. Местные лучевые реакции и повреждения являются нежелательным сопровождением лучевой терапии, т.к. приводят к вынужденным длительным перерывам, существенно снижают цитотоксический эффект от лучевого воздействия и неблагоприятно влияют на качество жизни пациенток.

До настоящего времени для оценки лучевой реакции со стороны слизистой оболочки влагалища специалисты ограничивались клиническими методами контроля, основываясь на данных осмотра при помощи зеркал. Оценка выраженности лучевых повреждений, в частности, эпителиитов влагалища проводилась в соответствии с классификацией Радиотерапевтической онкологической группы совместно с Европейской организацией по исследованию и лечению рака, RTOG/EORC, 1995 [A.M.Гранов, В.Л.Винокуров Лучевая терапия в онкогинекологии и онкоурологии, Санкт-Петербург, Фолиант, 2002 год, стр. 284-289] по следующим клиническим критериям.

- Реакция слизистых оболочек на лучевое воздействие начинается с гиперемии и отечности, нарастающих с увеличением дозы. Слизистая оболочка теряет свой блеск, кажется помутневшей, уплотненной за счет ороговения эпителия, что соответствует эпителииту 1 степени радиационного повреждения.

- Затем наступает десквамация ороговевшего эпителия; появляется островковый мукозит, способный продуцировать воспалительное серозно-геморрагическое отделяемое. Возникают островки пленчатого радиоэпителиита (2 степень радиационного повреждения).

- Далее отторжение эпителия принимает распространенный характер и очаги десквамации соединяются. Развивается сливной фибринозный мукозит, на ярко-красном фоне определяется эрозированная поверхность, покрытая белым фибринозным налетом (3 степень повреждения). Эпителизация эрозий занимает 10-15 дней, после чего, некоторое время еще отмечаются отечность и гиперемия слизистой оболочки.

- При неблагоприятном течении мукозитов возникают язвы, кровотечения, некроз (4 степень радиационного повреждения).

Очевидными недостатками этого способа являются субъективность оценки клинической картины повреждений слизистой оболочки влагалища в процессе лучевой терапии и невозможность архивировать получаемые данные. Кроме того, осмотр проводят, как правило, обычным визуальным способом без применения кольпоскопических приемов, позволяющих с увеличением, более детально описывать характеристики лучевых повреждений слизистой оболочки влагалища.

В известных источниках информации отсутствуют работы, описывающие микробиологические и другие лабораторные критерии оценки состояния эпителия влагалища у онкогинекологических больных. Известные источники посвящены проблемам нарушения микробиоциноза влагалища и описывают лечение больных с иными патологиями.

Известен способ оценки биоценоза полового тракта у пациенток, заключающийся в определении лизоцимной активности влагалища и флоры с подсчетом общего микробного числа (RU 2179849). Однако данный способ предназначен для оценки степени дисбиотических нарушений и не может быть результативен для оценки сохранности эпителиального слоя влагалища в процессе лучевой или химиолучевой терапии злокачественных новообразований.

В то же время известен способ оценки микробиоценоза влагалища, включающий цитологическую оценку состояния эпителиального слоя, в том числе количества лактобацилл (RU 2249821). Указанный способ включает очень трудоемкое проведение комплексной оценки состояния микробиоценоза влагалища при одновременном исследовании количественных показателей содержания факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры в отделяемом и в соскобе из влагалища в сочетании с определением компонентов гуморальной резистентности и барьерной функции слизистой оболочки влагалища.

В то же время для оценки состояния слизистой влагалища в процессе лучевой терапии с одной стороны нет необходимости проведения столь многостороннего исследования, а с другой стороны недостаточно ограничиться определением количества лактобацилл в эпителиальном слое влагалища.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи оценки состояния слизистой оболочки влагалища в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований на фоне сопроводительной терапии на основе объективных критериев.

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) и экономических результатов:

- возможность объективной оценки сохранности эпителиального слоя влагалища в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований,

- возможность прогнозирования развития радиационных осложнений во влагалище и, при необходимости, корректировки режима лучевого воздействия,

- повышение комплаентности лучевой терапии,

- доступность и невысокая себестоимость использования способа в условиях клинических лабораторий.

Указанные технические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что так же как в известном способе оценку состояния слизистой оболочки влагалища в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований осуществляют путем визуального осмотра.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что дополнительно оценивают степень сохранности эпителиального слоя влагалища путем определения наличия лактобацилл и их количества с помощью бактериоскопических и бактериологических исследований, а также определения наличия поверхностных и промежуточных клеток плоского эпителия с помощью цитологического исследования отделяемого влагалища. Лабораторные исследования проводят до начала лучевого воздействия, повторяют при подведении суммарной очаговой дозы (СОД) 20 Гр, 40 Гр и 60 Гр и через 1 месяц после окончания лечения.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Особенностью нормальной микрофлоры половых путей у женщин является ее многообразие. Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору влагалища, находятся между собой в разнообразных взаимоотношениях (нейтрализм, конкуренция, комменсализм, синергизм, паразитизм и др.). Изменение численности того или иного вида микроорганизмов в соответствующем биотопе или появление бактерий, несвойственных данному месту обитания, может служить сигналом для установления обратимости или необратимости изменений в соответствующем звене микроэкологической системы.

Колонизационная резистентность влагалища обусловлена, главным образом, резидентной микрофлорой, представленной у женщин репродуктивного возраста обширной группой лактобацилл. Благодаря специфической адгезии на эпителиальных клетках влагалища возникает биопленка, образованная микроколониями лактобацилл, окруженными продуктами их метаболизма - гликокаликсом.

Количество лактобацилл во влагалище здоровых женщин составляет 10⁵-10⁷ КОЕ/мл. Продукция эстрогенов у женщин репродуктивного возраста повышает содержание гликогена во влагалищном эпителии. Гликоген метаболизируется в глюкозу и в последующем с помощью лактобацилл - в молочную кислоту. Она обеспечивает низкий уровень pH (менее 4,5), способствует росту ацидофильных микроорганизмов, в частности лактобацилл. Помимо лактобацилл в состав влагалищного биоценоза входят более 40 видов других бактерий, однако их доля не превышает 5% общего количества микроорганизмов. У здоровых небеременных женщин ранговая последовательность бактериальных видов следующая: лактобациллы, бифидобактерии, пептококки, бактероиды, эпидермальные стафилококки, коринебактерии, гарднереллы, мобилункус, микоплазмы. Соотношение анаэробной флоры к аэробной составляет 10:1.

Радиационное воздействие на делящиеся клетки базального слоя эпителия влагалища должно было бы приводить к уменьшению клеточного обновления, атрофии слизистой оболочки и образованию эрозий и изъязвлений.

Однако авторами заявляемого способа установлено, что в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований онкогинекологических больных, проводимой с применением средства сопроводительной терапии - иммуномодулятора деринат «Колетекс-гель-ДНК», наблюдается цитопротективное действие указанного препарата. Деринат - высокомолекулярное физиологически активное природное вещество - вытяжка из молок осетровых или лососевых рыб, а именно натриевая соль двухспиральной высокоочищенной деполимеризованной нативной дезоксирибонуклеиновой кислоты (низкомолекулярной) с молекулярной массой 270-500 КД.

Клетки влагалищного эпителия, несмотря на радиобиологическое воздействие, которое, по сути, всегда имеет повреждающий характер, возвращают свои функциональные свойства, обеспечивающие им взаимодействие с индигенной лактобациллярной микрофлорой. Проявлением этого процесса является обнаружение и увеличение количества лактобацилл в образцах слизистой влагалища.

Для определения степени выраженности изменений и/или стабилизации функционального состояния эпителия влагалища, а также оценки эффективности проводимого лучевого воздействия необходимо повысить степени информативности лабораторного обследования путем проведения цитологических исследований, результаты которых также подтверждают указанные тенденции.

Авторами заявляемого способа разработаны следующие объективные критерии развития радиационных осложнений во влагалище у пациенток в процессе лучевой терапии злокачественных новообразований:

- наличие и изменение количества лактобацилл в образцах слизистой влагалища,

- наличие цитологических признаков сохранности эпителия, к которым относятся присутствие поверхностных и промежуточных клеток плоского эпителия.

Цитологические признаки сохранности эпителия систематизированы авторами в виде трех типов цитограмм:

1-й тип - отмечается появление отдельных клеток с полиморфизмом ядер, двухъядерных и многоядерных. Независимо от возраста обнаруживаются немногочисленные клетки поверхностных слоев плоского эпителия, паркератоз, гиперкератоз (дискератотические изменения).

2-й тип - мазок практически целиком представлен клетками поверхностного слоя плоского эпителия независимо от возраста с явлениями паракератоза и гиперкератоза.

3-й тип - цитологическая картина чаще возвращается к возрастной норме, могут иметь место атрофические изменения плоского эпителия, выявляются единичные клетки плоского эпителия с явлениями гиперкератоза.

Указанные критерии являются определяющими при решении вопроса о необходимости корректировки режима и целесообразности продолжения лучевого воздействия.

Таким образом, совокупность лабораторных признаков, не применявшаяся ранее для лабораторной оценки постлучевых эпителиитов влагалища, дает возможность объективно контролировать развитие радиобиологических осложнений у онкогинекологических больных.

Способ осуществляют следующим образом.

Перед началом лечения берут материал - отделяемое с боковой стенки влагалища в количестве 0,5 мл для бактериоскопического, бактериологического и цитологического исследования.

Бактериоскопический метод включает в себя приготовление и окраску мазков по Граму, метиленовой синыо, по Романовскому-Гимзе.

Бактериологический анализ (посев) производят количественно (то есть с разведением до 102-106 степени), посев осуществляют на твердую питательную среду, селективную для выделения лактобацилл. Культивирование лактобацилл осуществляют в микроаэрофильных и анаэробных условиях в течение 6 суток.

Цитологические исследования осуществляют с препаратами на стеклах, окраска по Паппенгейму в модификации Лейшмана (азур-эозином).

Алгоритм лабораторных исследований повторяют при подведении суммарной очаговой дозы (СОД) 20 Гр, 40 Гр и 60 Гр. Через 1 месяц после окончания лечения проводят контрольное исследование по той же методике.

В МНИОИ им. П.А.Герцена исследования проведены у 22 онкогинекологических больных.

Исходно, до начала лечения, у большинства пациенток в цитологических мазках присутствовали клетки как поверхностных, так и промежуточных эпителиальных клеток, которые при подведении СОД=20-40 Гр исчезали, а после 40 Гр вновь появлялись в мазках.

В табл.1 отражены статистические показатели частоты обнаружения лактобацилл в слизистой влагалища онкогинекологических больных при различных дозах лучевого воздействия.

Из таблицы видно, что в процессе облучения пораженных областей выявляемость лактобацилл увеличивается, хотя более ожидаемым было бы, напротив, их исчезновение под действием ионизирующего облучения.

Таким образом, использование в клинической практике заявляемого способа позволило оптимизировать режим лучевой терапии онкогинекологичесих больных. Курс облучения прерывался на 7-10 дней для купирования лучевой реакции только в ситуации полного отсутствия лактобацилл по данным бактериоскопического и бактериологического исследований, а также отсутствия или очень небольшого количества поверхностных и промежуточных эпителиальных клеток в цитологических мазках. Данная клиническая картина характеризовалась катаральным или пленчатым эпителиитом. Проводились ежедневные обработки влагалища, аппликации «Колетекс-гель-ДНК». Курс облучения возобновлялся при стихании лучевой реакции. Стихание лучевой реакции сопровождалось появлением лактобацилл и клеток поверхностных и промежуточных слоев плоского эпителия.

Клинический пример.

Пациентка Т., 45 лет. Диагноз: Рак эндометрия Из стадии (TlbNoMo). Морфологическое заключение - высокодифференцированная эндометриоидная аденокарцинома тела матки.

На 1 этапе комбинированного лечения выполнена операция - экстирпации матки с придатками. На 2 этапе проведен курс сочетанной лучевой терапии с подведением СОД (суммарная очаговая доза) на культю влагалища 60 Гр.

До лечения слизистая влагалища была не измененной, в дне купола культи шовный материал. Лактобациллы выделены бактериологическим методом в количестве 1×10³ КОЕ. В цитологическом мазке - поверхностные, промежуточные, парабазальные клетки, нити фибрина, лейкоциты единичные в полях зрения, в скоплениях до 20.

При СОД=20 ГР - по данным осмотра также слизистая влагалища была не изменена Лактобациллы не определялись. В цитологическом мазке - парабазальный, базальный слои, паракератоз с укрупненными ядрами, лейкоциты до 5 в п/зр, частью лизированные, что соответствует 1-му типу цитограммы.

При СОД=40 Гр при осмотре при помощи зеркал слизистая влагалища ярко гиперемирована, с фокусами пленчатого эпителиита. Несмотря на развитие выраженного лучевого эпителиита, лактобациллы были выделены бактериологическим методом в количестве 2×10⁴ КОЕ. А в цитологическом мазке появились поверхностные, промежуточные клетки, присутствовали парабазальные слои, паракератоз, гиперкератоз, двухъядерные и многоядерные клетки, укрупнение ядер, лейкоциты 5-25 в поле зрения, частью разрушенные, нити фибрина, что соответствует 2-му типу цитограммы.

Руководствуясь результатами лабораторных исследований курс лучевой терапии решено не прерывать и облучение было продолжено. Проводились ежедневные обработки влагалища препаратом дерината «Колетекс-гель-ДНК».

При СОД=60 Гр слизистая влагалища сохранялась незначительно гиперемированной, в куполе культи пленчатый эпителиит.Лактобациллы выделены бактериологическим методом в количестве 4×10⁴ КОЕ. В цитологическом мазке поверхностные, промежуточные клетки, гиперкератоз, паракератоз, лейкоциты 15-30, частью в скоплениях слизи, частью разрушенные, нити фибрина (2-й тип цитограммы).

Через 1 месяц после завершения лечения, как по данным осмотра, так и по лабораторным данным отмечены признаки полной регенерации эпителия влагалища: слизистая влагалища не изменена, не гиперемирована. Лактобациллы выделены бактериологическим методом в количестве 2×10⁴ КОЕ. В цитологическом мазке - промежуточные, базальные, парабазальные клетки, дискератоз, двухядерные клетки, лейкоциты 30 в поле зрения, частью разрушенные, нити фибрина, соответствует 3-му типу цитограммы.

Таким образом, использование в клинической практике заявляемого способа дает возможность объективно контролировать развитие радиобиологических изменений слизистой влагалища у онкогинекологических больных, что, в свою очередь, позволяет четко следовать индивидуальным планам лучевого лечения, не изменяя сроков лучевого воздействия и используемых доз.