Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НЕГАТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР НА ПРЕДСТАТЕЛЬНУЮ ЖЕЛЕЗУ КРЫС

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной морфологии.

В результате проведенного патентного поиска других препаратов по уменьшению негативных эффектов низких температур на предстательную железу крыс выявлено не было.

Задача изобретения заключается в создании способа коррекции негативных эффектов низких температур на предстательную железу лабораторных животных.

Предложен способ применения препарата моллюскам, получаемого путем гидролиза из моллюсков Тихого океана, для коррекции негативных эффектов низких температур на предстательную железу крыс. В его состав входят такие аминокислоты, как лизин - 4,1%, лейцин - 4,0%, фенилаланин - 3,2%, триптофан - 3,2%, треонин - 3,2%, валин - 2,5%, изолейцин - 2,4% метионин - 2,1%, аргинин - 4,0%, гистидин - 0,9%, глицин - 11,2%, глутаминовая кислота - 4,2%, аланин - 3,2%, аспарагиновая кислота - 3,0%, серии - 1,6%, тирозин - 1,3%, пролин - 1,2%, таурин - 7,8%, гистидинсодержащие дипептиды - от 2,0 до 4,0% [Биологически активная добавка к пище «Моллюскам». Н.Н. Беседнова с соавт. Владивосток: ТИНРО - центр, 2007].

Способ осуществляется следующим образом.

В эксперименте изучалось влияние препарата моллюскам на структурный гомеостаз предстательной железы при действии на организм животных низких температур. Для этого экспериментальные животные (40 беспородных белых крыс-самцов) были разделены на три группы: группу контроля составили интактные крысы (n 10), содержавшиеся в виварии при 18-20°C, крысы второй группы (группа сравнения, n 15) и третьей группы (группа коррекции, n 15), которые охлаждались в климатокамере «ILKA» при температуре -15°C по 3 часа ежедневно на протяжении 4-х недель с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции. Режим охлаждения был выбран с учетом возникновения в таких условиях в тканях и органах подопытных животных выраженных биохимических и морфологических изменений [Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам, И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко, Сибирский медицинский журнал, Том 106, №7, 2011]. Крысы из группы коррекции ежедневно перед охлаждением получали перорально моллюскам в дозе 10 мг/кг массы тела. В качестве объекта исследования был использован орган репродуктивной системы самцов белых крыс, а именно дорсолатеральные доли предстательной железы, являющиеся структурным эквивалентом простатических желез человека. Для получения предстательной железы и крови после окончания эксперимента лабораторных животных умерщвляли под тиопенталовым наркозом путем декапитации.

Негативные эффекты низких температур на предстательную железу, а также корригирующее действие препарата моллюскам оценивали гистохимическими (ШИК-реакция, реакция с дитизоном), иммуногистохимическими (выявление индуцибельной формы NO-синтетазы и E-кадгерина), количественными (определение оптической плотности продуктов реакции в программе «Морфология 5.0»), биохимическими и статистическими методами.

Результаты способа представлены на чертежах:

Фиг.1 - Предстательная железа. ШИК-реакция:

1а - крысы из группы контроля;

1б - крысы из группы сравнения;

1в - крысы из группы коррекции.

Фиг.2 - Предстательная железа. Цитохимическая реакция с дитизоном:

2а - крысы из группы контроля;

2б - крысы из группы сравнения;

2в - крысы из группы коррекции.

Фиг.3 - Предстательная железа. Иммуноцитохимическая реакция на индуцибельную NO-синтетазу:

3а - крысы из группы контроля;

3б - крысы из группы сравнения;

3в - крысы из группы коррекции.

Фиг.4 - Предстательная железа. Иммуноцитохимическая реакция на Е-кадгерин:

4а - крысы из группы контроля;

4б - крысы из группы сравнения;

4в - крысы из группы коррекции.

Как показано на Фиг.1а, железистый эпителий, выстилающий секреторные отделы дорсолатеральной простаты интактных крыс, содержит большое количество гликопротеинов, придающих цитоплазме клеток ШИК-позитивные свойства (позиция 1). На Фиг.1б показано, что после 4-х недель воздействия низких температур активность ШИК-реакции в эпителии предстательной железы резко снижена (позиция 1), что указывает на нарушение синтеза гликопротеинов железистыми клетками. На Фиг.1в показано, что железистый эпителий предстательной железы крыс, получавших моллюскам, содержит ШИК-позитивные вещества (позиция 1), что указывает на восстановление синтетической функции эпителиоцитов.

На Фиг.2а представлены результаты цитохимической реакции с дитизоном, согласно которым в эпителии предстательной железы интактных крыс содержатся высокие концентрации цинка (позиция 2). На Фиг.2б (позиция 2) показано, что после 4-х недель низкотемпературного воздействия содержание цинка в эпителии предстательной железы резко снижается. Цинк обеспечивает функцию накопления и секреции цитрата эпителиоцитами предстательной железы, обладает антипролиферативным, антибактериальным и антиоксидантным свойствами [Castration- and aging-induced changes in the expression of zinc-transporter and metallothionein in rat prostate, К. Iguchi et al., Journal of Andrology, 2011, Vol.32, №2]. Следовательно, дефицит цинка является причиной серьезных нарушений гомеостаза предстательной железы. Снижение концентрации цинка в эпителии предстательной железы связано с нарушением синтеза эпителиальными клетками транспортеров цинка и металлотионеинов [Castration- and aging-induced changes in the expression of zinc-transporter and metallothionein in rat prostate, K. Iguchi et al., Journal of Andrology, 2011, Vol.32, №2]. На Фиг.2в (позиция 2) показано, что в эпителии предстательной железы крыс, получавших моллюскам, цинка содержится больше, чем у крыс из группы сравнения. Высокое содержание хелатируемого цинка свидетельствует о восстановлении синтеза транспортных белков эпителиоцитами, восстановлении барьерной функции и антиоксидантной защиты простатического эпителия.

На Фиг.3а (позиция 3) показано, что в эпителии предстательной железы интактных крыс присутствуют продукты иммуногистохимической реакции на индуцибельную NO-синтетазу в виде преципитатов коричневого цвета. После 4-х недель холодового воздействия эпителий предстательной железы полностью утрачивает иммунопозитивные свойства (Фиг.3б (позиция 3)), что указывает на резкое угнетение экспрессии индуцибельной формы NO-синтетазы. У крыс, получавших моллюскам, в эпителии предстательной железы выявляются продукты реакции на NO-синтетазу в виде преципитатов светло-коричневого цвета, что представлено на Фиг.3в (позиция 3). Оксид азота, образующийся с участием NO-синтетазы, играет важную роль в холодовой адаптации различных тканей и органов млекопитающих [The effects of cold acclimation and nitric oxide on antioxidative enzymes in rat pancreas, A. Vasilijevic et al. Comparative Biochemistry and Physiology, 2007, Vol.145; Antioxidative defence alterations in skeletal muscle during prolonged acclimation to cold: role of L-arginine/NO-producing pathway, V. Petrovic et al., The Journal of Experimental Biology, 2008, Vol.211]. Восстановление на фоне приема моллюскама экспрессии NO-синтетазы в эпителии предстательной железы указывает на полноценно протекающий процесс холодовой адаптации.

На Фиг.4а показано, что в эпителии предстательной железы интактных крыс присутствуют продукты иммуногистохимической реакции на Е-кадгерин в виде преципитатов коричневого цвета (позиция 4). На Фиг.4б отмечено, что после 4-х недель адаптации иммунопозитивные свойства эпителия предстательной железы резко снижены (позиция 4), что указывает па угнетение экспрессии клетками Е-кадгерина. На Фиг.4в (позиция 4) в эпителии предстательной железы крыс, получавших моллюскам, представлены продукты реакции на Е-кадгерин в виде преципитатов светло-коричневого цвета, что свидетельствует о восстановлении синтеза Е-кадгерина эпителиальными клетками.

Е-кадгерин является важнейшим адгезивным белком, обеспечивающим межклеточные взаимодействия между эпителиальными клетками, предупреждая тем самым пролиферацию и опухолевый рост железистого эпителия предстательной железы [Developmental Exposure to Estrogens Alters Epithelial Cell Adhesion and Gap Junction Proteins in the Adult Rat Prostate, H. Habermann et al., Endocrinology, 2001, Vol.142]. Следовательно, восстановление синтеза Е-кадгерина положительно сказывается на межклеточных взаимодействиях эпителиоцитов предстательной железы.

В ходе эксперимента было установлено, что при холодовом воздействии в сыворотке крови крыс накапливается малоновый диальдегид (табл.1). В сыворотке крови крыс, получавших моллюскам, содержание малонового диальдегида достоверно ниже, чем у животных из группы сравнения, и не имеет различий с группой контроля. Установлено, что в сыворотке крови крыс, получавших моллюскам, по сравнению с группой сравнения статистически значимо увеличивается содержание витамина Е (табл.1). Таким образом, моллюскам проявляет умеренные антиоксидантные свойства, уменьшая биохимические проявления окислительного стресса в сыворотке крови крыс.

Пример 1

В течение 4-х недель одна группа крыс подвергалась охлаждению в климатокамере «ILKA» при температуре -15°C по 3 часа ежедневно. В это же время другая группа крыс ежедневно на протяжении 4-х недель перед охлаждением получала перорально вместе с пищей моллюскам в дозе 10 мг/кг массы тела.

После окончания охлаждения осуществляли забой животных для оценки структурного гомеостаза предстательной железы.

Количественный анализ показал статистически значимое уменьшение оптической плотности продуктов ШИК-реакции в эпителии предстательной железы крыс из группы сравнения (табл.2), в то время как в эпителии простаты крыс из группы коррекции оптическая плотность продуктов ШИК-реакции достоверно выше, чем в группе сравнения (табл.2).

Количественная оценка цитохимической реакции с дитизоном показала резкое снижение оптической плотность продуктов реакции в эпителии предстательной железы крыс из группы сравнения (табл.2). Оптическая плотность продуктов реакции в эпителии предстательной железы крыс из группы коррекции статистически значимо выше, чем в группе сравнения (табл.2).

Результаты иммуноцитохимической реакции на индуцибельную NO-синтетазу показали, что оптическая плотность продуктов реакции в эпителии предстательной железы крыс статистически значимо снижена по сравнению с контролем (табл.2), в то время как оптическая плотность продуктов реакции в эпителии простаты крыс из группы коррекции достоверно выше, чем в группе сравнения (табл.2).

Количественный анализ иммуноцитохимической реакции на Е-кадгерин показал, что оптическая плотность продуктов реакции в эпителии предстательной железы из группы сравнения достоверно ниже, чем в группе контроля (табл.2), а в эпителии крыс из группы коррекции статистически значимо выше, чем в группе сравнения (табл.2).

Согласно результатам биохимического исследования в сыворотке крови крыс из группы сравнения отмечается статистически значимое повышение уровня малонового диальдегида (табл.1). В сыворотке крови крыс из группы коррекции содержание малонового диальдегида достоверно ниже, чем у животных из группы сравнения, и не имеет различий с группой контроля (табл.1). В сыворотке крови крыс из группы сравнения статистически значимо снижается уровень витамина Е, в сыворотке крови крыс из группы коррекции уровень витамина Е достоверно выше, чем в группе сравнения (табл.1).

Результаты проведенного исследования показали, что при действии низких температур нарушается синтетическая активность эпителия предстательной железы, на что указывают снижение концентрации гликопротеинов, хелатируемого цинка, угнетение экспрессии NO-синтетазы и Е-кадгерина. На фоне приема моллюскама в эпителии увеличивается содержание гликопротеинов и хелатируемого цинка, увеличивается экспрессия NO-синтетазы и Е-кадгерина, что в совокупности свидетельствует о восстановлении синтетической функции эпителия предстательной железы.

Технический результат изобретения заключается: 1.) В уменьшении негативных эффектов низких температур на предстательную железу лабораторных животных при помощи препарата моллюскам, а именно восстановлении секреторной функции эпителия предстательной железы; 2.) В расширении арсенала средств, обладающих адаптогенными свойствами.

Источники информации

1. Беседнова Н.Н. Биологически активная добавка к пище «Моллюскам» (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Т.С Запорожец // Методическое пособие для врачей. - Владивосток: ТИНРО-центр. - 2007. - 40 с.

2. И.Ю. Саяпина, С.С. Целуйко. Окислительный стресс в предстательной железе на этапах адаптации организма к низким температурам // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Том 106, №7. - С.31-34.

3. Iguchi, К. Castration- and aging-induced changes in the expression of zinc-transporter and metallothionein in rat prostate / K. Iguchi, N. Morihara, S. Usui, M. Hayama, Y. Sugimura, K. Hirano // Journal of Andrology. - 2011. - Vol.32, №2. - P. 253-258.

4. Petrovic V. Antioxidative defence alterations in skeletal muscle during prolonged acclimation to cold: role of L-arginine/NO-producing pathway / V. Petrovic, B. Buzadzic, A. Korac, A. Vasilijevic, A. Jankovic, K. Micunovic, B. Korac // The Journal of Experimental Biology. - 2008. - Vol.211, P. 114-120 5. Vasilijevic A. The effects of cold acclimation and nitric oxide on antioxidative enzymes in rat pancreas / A. Vasilijevic, B. Buzadzic, A. Korac et al. // Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. - 2007. - Vol.145, №4. - P. 641-647.

6. Habermann H. Developmental Exposure to Estrogens Alters Epithelial Cell Adhesion and Gap Junction Proteins in the Adult Rat Prostate, H. Habermann et al. // Endocrinology. - 2001. - Vol.142, P. 359-369.