Результат интеллектуальной деятельности: Способ коррекции кожи крыс к холодовому воздействию

Изобретение предназначено для использования в медицине и косметологии.

В последнее время все большее внимание со стороны ученых-исследователей приковывают к себе Арктика и другие северные области Земли. Холодный климат данных территорий обуславливает необходимость поиска, разработки и апробации эффективных и адекватных средств защиты от холода как всего тела, так и дистальных отделов рук и ног, в которых теплообмен имеет большое значение в профессиональной деятельности рабочих в условиях холода и играет важную роль в формировании теплового состояния всего организма [3,4].

Было произведено множество различных экспериментов, где ткани сохранялись с помощью глицерина, а для перфузии использовались различные растворы, например растворы кристаллоидов. Разрабатывалось множество способов удаления глицерина из тканей после отогревания, но больших успехов в этой области не было достигнуто.

Другие криопротекторы, такие как диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль, как и глицерин, хорошо проникают в клетки в процессе их замораживания, чем уравновешивают осмотический градиент при отогреве и модифицируют кристаллы льда таким образом, что они становятся рыхлыми и не наносят больших разрушений клетке [9].

Недостатком данной группы соединений является то, что для эффективной криозащиты биологических объектов необходимо использовать растворы достаточно высокой концентрации (например, 5% раствор диметилсульфоксида в растворе Рингера), что обусловливает их цитотоксический эффект. Диметилсульфоксид также способен усиливать и токсичность большинства лекарственных препаратов [7].

К перспективным веществам, которые можно использовать для криопротекции, следует отнести полимер дигидрокверцетина. Это полимерное вещество, получаемое из древесины лиственницы сибирской и лиственницы даурской, мономером которого является флаваноид дигидрокверцетин.

Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является создание способа, позволяющего использовать дигидрокверцетин в виде мази, как корректор при холодовом воздействии на кожу крыс.

Дигидрокверцетин это основное флаваноидное соединение древесины лиственницы сибирской [1, 2]. Известно, что это вещество имеет широкий спектр фармакологических эффектов, а именно повышает антиоксидантную активность, обладает противовоспалительным и противоотечным действиями, нормализует синтез коллагена в дерме кожи [5, 10]. Согласно мнению ряда авторов, высокий антиоксидантный эффект дигидрокверцетина позволяет использовать его в качестве криопротектора, как вещество, предупреждающее отек клеток и структур соединительной ткани [7, 9].

Сущность изобретения заключается в том, что способ коррекции кожи крыс к холодовому воздействию включает смазывание участков кожи задних конечностей крыс 2,5% мазью дигидрокверцетина на вазелиновой основе (путем простого смешивания 100 гр вазелина и 2,5 гр дигидрокверцетина в порошке) в одно и тоже время, один раз в сутки, в течениие 7 дней, а затем - холодовое воздействие на обработанные мазью участки кожи жидким азотом, при температуре -196°C, в течение 1,5 минут.

Изобретение поясняется рисунками: фиг. 1 - воздействие холода, окраска гематоксилин-эозин; фиг. 2 - воздействие холодом на фоне применения 2,5% мази дигидрокверцетина на вазелиновой основе; фиг. 3 - воздействие холодом, реакция на NO - синтетазу; фиг 4 - воздействие холодом на фоне применения 2,5% мази дигидрокверцетина на вазелиновой основе.

Способ осуществляется следующим образом. В течение 7 дней, в одно и тоже время - один раз в сутки, например, в 09.00 часов, смазывали участки кожи задних конечностей крыс 2,5% мазью дигидрокверцетина на вазелиновой основе. Затем, по прошествии 7 дней, осуществляли холодовое воздействие на обработанные мазью участки кожи, при помощи жидкого азота при температуре -196°С в течение 1,5 минут.

Для подтверждения способа проводилось исследование, при котором использовались 70 белых беспородных половозрелых крыс-самцов с массой тела 150-200 г.

Животные были разбиты на три группы: 1) интактная, содержащаяся в условиях вивария и забитая в конце эксперимента; 2) контрольная - группа подвергалась действию холодового фактора на кожу, путем применения жидкого азота -196°С в течение 1.5 минут. 3) экспериментальная - в течение 7 дней применяли 2,5% мазь дигидрокверцетина на вазелиновой основе, после чего проводили воздействие жидким азотом по аналогии как во второй группе. Материал для исследования во второй и третьей группах был взят через 30 минут после воздействия жидкого азота на участок кожи.

Объектом исследования служил материал кожи задних конечностей белых лабораторных крыс, взятый на морфологическое исследование.

В исследовании применялись морфометрический, биохимический методы.

Морфометрическое исследование проводилось на полуавтоматическом программно-аппаратном комплексе анализа изображения персонального компьютера со специальной программой для морфометрических вычислений «Морфометр». Для морфологического исследования материал кожи окрашивали гематоксилином-эозином, а также для определения инцуцибельной NO-синтетазы использовали антитело. Воздействие NO приводит к повышению ими продукции супероксид-аниона и пероксинитрита, оказывающих повреждающее действие, а также к увеличению нитротирозиновых остатков. Степень активности инцуцибельной NO-синтетазы оценивается по интенсивности коричневого окрашивания при иммуногистохимическом выявлении [5, 11].

Биохимическими методами определяли в плазме крови показания диеновых конъюгатов [8].

На гистологических препаратах кожи интактных крыс отклонений от нормальной морфологии кожи не выявлено. Соотношение слоев эпидермиса и дермы не изменено.

Изучение материалов второй группы (на которую воздействовали только жидким азотом -196°С в течение 1.5 минут) показало следующие морфологические изменения: границы между слоями эпидермиса и самими клетками стушеваны, ядра клеток базального и зернистого слоев пикнотизированы, т.е. наблюдаются явления паранекроза. Краситель прокрашивает клетки эпидермиса диффузно, протоплазма эпителиоцитов вакуолизирована. Со стороны сосудов сосочкового слоя дермы наблюдаются явления стаза, отмечается стойкий спазм сосудов дермы, что говорит о явлениях холодового стресса (Фиг. 1). Обнаружено, что в сосочковом слое дермы при отморожении в периоде холодовой травмы интенсивность окраски индуцибельной NO-синтетазы увеличивается, что указывает на выраженность воспалительных явлений в сосочковом слое (Фиг. 3). Морфометрические значения высоты эпидермиса снижены (табл. 1). В периферической крови наиболее значительно повышаются содержание диеновых конъюгатов (табл. 2).

В третьей группе при местном применении дигидрокверцетина, а затем жидкого азота, со стороны эпидермиса наблюдается эффект отшелушивания, что говорит о кератолитическом действии препарата дигидрокверцетина, процессы кератинизации протекают без особенностей. Со стороны дермы выявлен отек средней степени выраженности в сетчатом слое, кроме того, отмечается усиление фибробластической реакции. Полученные данные указывают на положительное влияние препарата на водно-электролитный, белковый обмены в коже и стимулирующем воздействии на синтез гликозаминогликанов при местном применении дигидрокверцетина (Фиг. 2). Интенсивность окрашивания NO-синтетазы после отморожения нарастает менее выражено, что свидетельствует о противовоспалительном действии дигидрокверцетина (Фиг. 4). Морфометрически значения высоты эпидермиса выше, чем без коррекции дигидрокверцетином (табл. 1). Применение дигидрокверцетина приводит к снижению уровня диеновых конъюгатов и повышению уровня витамина Е, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном эффекте дигидрокверцетина (табл. 2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу применения 2,5% мази на основе дигидрокверцетина местно, где отмечается видимый криопротекторный эффект.

Технический результат использования изобретения заключается в том, что просто и доступно, с помощью местного применения дигидрокверцетина, можно снизить уровень структурных повреждений кератиноцитов, уменьшить реактивные явления со стороны рыхлой соединительной ткани и сосудов микроциркуляторного русла дермы. Это дает возможность значительно снизить последствия влияния низких температур на кожу для людей, живущих и работающих в районах с низкими температурами окружающей среды.

Список литературы:

1. Адаскевич В.П., Мяделец О.Д., Саларев В.В. Актуальная дерматология - Москва. Медицинская книга, 2000. - 300 с.

2. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Малков Ю.А., Иванова С.З., Онучина Н.А., Бабкин Д.В. Биологически активные экстрактивные вещества из древесины лиственницы // Химия в интересах устойчивого развития. 2001. №3.

3. Доровских В.А., Бородин Е.А., Целуйко С.С. Антиоксиданты в профилактике и коррекции холодового стресса. - Благовещенск: АГМА, - 2001. - 183 с.

4. Котельников В.П. Отморожения. - М.: Медицина, 1988. - 256 с.

5. Мяделец О.Д., Адаскевич В. П. Морфофункциональная дерматология - Москва 2006 - С. 655-656.

6. Ноздрин В.И., Барашкова С.А., Семченко В.В. Кожа и ее производные - Омск - Орел - 2005. - 7-24 с.

7. Пастухов Ю.В., Максимов А.Л., Хаскин В.В. Адаптация к холоду и условиям субарктики: проблемы термофизиологии. - Магадан. - 2003 -373 с.

8. Стальная Н.Д. Методы определения некоторых продуктов перекисного определения липидов в тканях животных. - Москва. - 1977 - С. 62-68.

9. Теселкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В. И др. Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина Учебник «Биофизика» 1996. Т. 41, вып.3. С. 620-624.

10. Gnaiger Е., Kuznetsov А.V., Rieger О., Amberger A., Fuchs A, Stadlmann S., Eberl T., Margreiter R. Mitochondrial defects by intracellular calcium overload versus endothelial coldischaemia/reperfuston injury // Transplant International. - 2000. - T. 13. - N.7. - P. 555-557.

11. Ken Nakagawa, Dicken D.H Koo, David R. Davies, Derek W.R Gray, Andrew J. Mclaren, Kenneth I. Welsh, Peter J. Morris, Susan V. Lecithinized superoxide dismutase reduces cold ischemia-induced chronic allograft dysfunction / Fugglekidney international // T. - 61 - 2002 - P. 1160-1169.