Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕТОКСИКАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ОРГАНИЗМА У РАБОТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ХИМИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

Нефтехимическая и химическая отрасли занимают одно из ведущих мест по потенциальной опасности химического воздействия. Опасному токсическому воздействию подвержены работники, занятые в условиях химического комплекса [Карамова, Л.М. Профессиональный риск для здоровья работников химических и нефтехимических производств / Л.М.Карамова, Л.К.Каримова, Г.Р.Башарова. - Уфа, 2006. - 306 с].

Системе детоксикации организма человека отводится первостепенная роль в инактивации токсического действия химических веществ. Важнейшим механизмом данной системы являются антиокислительные процессы. Известно, что при воздействии на организм химических веществ происходит усиление генерации активных форм кислорода и перекиси водорода, сопровождающееся активацией механизмов антиокислительной защиты [Сосюкин А.Е. Общие механизмы токсического действия и возможные пути ускорения процессов восстановления после тяжелых острых отравлений / А.Е.Сосюкин, А.В.Смирнов, И.В.Аксенов и др. // Клиническая медицина и патофизиология. - 1997. - №2. - С.57-67.].

Хроническое воздействие токсических веществ, которому подвергаются сотрудники, занятые в условиях химического комплекса, вызывает неспецифическую активацию защитных механизмов организма человека, в числе которых антиокислительные процессы [Л.Б.Маснавиева // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН, 2007., №1 - С.229-230.].

По мнению ряда авторов, определение антиокислительной активности является интегральным показателем способности организма противостоять патологическим процессам, при которых повышается количество активных форм кислорода (Титов В.Н. Антиокислительная активность плазмы крови - тест нарушения биологической функций эндоэкологии, экзотрофии и реакции воспаления. В.Н.Титов, В.В.Крылин, В.А.Дмитриев, Я.И.Яшин. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №7. - С.3-14.]

Важнейшими ферментами антиокислительных процессов являются супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза. Известен способ определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах [Woolliams J.A., Wiener G., Anderson P.H., Mcmurray C.H. Research in Veterinary Science 1983, 34 pp 253-256.], глутатионпероксидазы в эритроцитах [Paglia D.E., Valentine, W.N., J. Lab. Clin.Med., 1967,70 pp 158, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom ВТ 29 4 QY], глутатионредуктазы в эритроцитах [Goldberg D.M., Spooner R.J. Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyen, H.V.) 3 end. vol 3, pp 258-265, Veriog Chemie, Deerfield Beach.Fl.].

Однако не существует интегрального показателя, в целом характеризующего степень нарушения детоксикационной функции у работающих в условиях химического комплекса.

Прототипом изобретения является способ оценки общего оксидантного статуса организма, заключающийся в том, что определяют общую оксидантную активность по степени окисления эхинохрома A компонентами оксидантной системы сыворотки или плазмы крови и общую антиоксидантную активность определяют по степени окисления эхинохрома A хлорамином B, добавленного к сыворотке или плазме крови [патент RU 2407450, 2009 г.].

Недостатком данного метода является отсутствие интегрального показателя, который может выступать в качестве критерия состояния важнейших этапов антиоксидантной защиты организма при воздействии ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси.

Супероксиддисмутаза (СОД) является ключевым ферментом, непосредственно обеспечивающим обрыв цепей кислородзависимых свободнорадикальных реакций в клетках аэробных механизмов [Л.Т.Рязанцева. Ферменты-антиоксиданты: структурно-функциональные свойства и роль в регулировании метаболических процессов. Вестник Воронежского государственного технического университета 2011, Т.7, №2, С.126-129]. Глутатионпероксидаза (ГП) - фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Глутатионредуктаза (ГР) участвует в дальнейшей инактивации активных форм кислорода [Маханова Р.С. К вопросу изучения перекисного окисления липидов. Известия Оренбургского государственного аграрного университета 2011, №29-1 231-234]. При снижении указанных ферментов снижается детоксикационная функция организма.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа оценки детоксикационной функции организма у работающих в условиях химического комплекса.

Технический результат - повышение точности оценки детоксикационной функции организма у работающих в условиях химического комплекса.

Предлагаемый способ оценки детоксикационной функции организма у работающих в условиях химического комплекса включает определения активности супероксиддисмутаза и глутатионредуктазы в лизате эритроцитов, глутатионпероксидазы в эритроцитах цельной крови. После чего вычисляют показатель детоксикационной функции организма.

Определение активности супероксиддисмутазы в лизате эритроцитов (СОД).

Определение активности супероксиддисмутаза в лизате эритроцитов проводят на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat-Fax 1904 plus. Исследование включает пробоподготовку для получения отмытых эритроцитов, проведение процедуры их лизиса, дальнейшее определение активности СОД в лизате эритроцитов.

Расходные материалы

1. Набор для определения активности СОД, производитель Randox Laboratories LTD, Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom ВТ 29 4 QY, содержащий: a) R1a смешанный субстрат (ксантин и I.N.T.), R1b - буфер, б) R2-ксантин оксидаза, в)CAL-стандарт.

2.Фосфатный буфер 0,01 М pH 7,0

Приготовление реактивов

1. Приготовление 0,01 М фосфатного буфера рН 7,0.

Реактив A: 0,01 М KH2PO4 (0,68 г на 1 л)

Реактив B: 0,01 М Na2HPO4 (1,56 г на 1 л)

Соединяют 48,8 мл реактива A и 51,2 мл реактива B, проверяют pH на приборе.

2. Построение калибровочной кривой

а) Для построения калибровочной кривой растворяют 1 флакон стандарта из набора в 10 мл бидистиллированной воды, готовят шкалу разведений с фосфатным буфером 0,01 М (pH 7,0) - 6 концентраций,

б) готовят реагенты R1 и R2 по методике набора для определения активности СОД,

в) проводят реакции: 0,05 мл стандарта добавляют 1,7 мл R1, хорошо перемешивают, добавляют 0,25 мл R2 (ксантин оксидазу), перемешивают, через 30 секунд определяют начальную оптическую плотность A1 на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat-Fax 1904 plus при длине волны 505 нм, одновременно начинают отсчет времени. Определяют конечную оптическую плотность A2 через 3 минуты.

г) расчет:

- определяют ΔA=(A2-A1)/3,

- определяют процент ингибирования для каждой пробы. При этом скорость измерения оптической плотности Ransod разбавителя принимают за 100%=скорость неингибируемой реакции.

- Все скорости изменения оптической плотности разведенных стандартов

должны быть конвертированы в проценты относительно скорости

изменения Ransod Разбавителя Проб (фосфатный буфер), после чего для определения процента ингибирования полученные значения различных разведений стандарта (в процентах) вычитают из 10.

- построение калибровочного графика.

Откладывают % ингибирования для каждого разведения стандарта против Log 10 и строят кривую процентного ингибирования для каждой точки разведения стандарта со шкалой Log 10 (концентрация стандарта в единицах СОД/мл).

3. Подготовка пробы к исследованию:

а) берут 0,5 мл цельной крови,

б) центрифугируют 0,5 мл цельной крови при 3000 об/мин в течение 10 минут, после чего аспирируют плазму. Затем промывают эритроциты четыре раза в 3 мл 0,9% NaCl, эритроциты центрифугируют после каждой промывки при 3000 об/мин в течение 10 минут,

в) к отмытым эритроцитам добавляют такое количество холодной бидистиллированной воды, чтобы общий объем смеси составил 2,0 мл, перемешивают, инкубируют 15 минут при температуре +4°C.

Лизат разводят 0,01 моль/л фосфатным буфером pH 7,0 так, чтобы процент ингибирования составил 30-60%.

4. Проведение реакции

Берут 0,05 мл лизата, полученного в ходе пробоподготовки, добавляют 1,7 мл R1, хорошо перемешивают, добавляют 0,25 мл R2 (ксантин оксидазу), перемешивают, через 30 секунд определяют начальную оптическую плотность A1 на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat-Fax 1904 plus при длине волны 505 нм, одновременно начинают отсчет времени. Определяют конечную оптическую плотность A2 через 3 минуты.

5. Расчет активности СОД

а) определяют ΔA=(A2-A1)/3,

б) определяют процент ингибирования для каждой пробы. При этом скорость измерения оптической плотности Ransod разбавителя принимали за 100%=скорость неингибируемой реакции,

в) все скорости изменения оптической плотности исследуемых проб должны быть конвертированы в проценты относительно скорости изменения Ransod Разбавителя Проб (фосфатный буфер), после чего для определения процента ингибирования полученные значения для каждой пробы (в процентах) вычитают из 100%.

г) используя процент ингибирования пробы, можно получить с помощью калибровочной кривой числовое значение активности в единицах СОД,

д) перевод в СОД ед/грамм-гемоглобин (ед/г Hg)

Определение активности глутатионпероксидазы в цельной крови

Определение активности глутатионпероксидазы в цельной крови проводят на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat-Fax 1904 plus.

Расходные материалы

Набор для определения активности глутатионпероксидазы (производитель Randox Laboratories LTD, Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom ВТ 29 4 QY), содержащий: a) R1a реактив, R1b - буфер, 6) R2-кумин гидропероксид, в) R3-дилюент

1. Приготовление реактивов:

а) растворяют содержимое одного флакона реактива R1a в 6,5 мл R1b.

Стабилен 48 часов в холодильнике.

б) растворяют 10 мкл R2 в 10 мл R3, тщательно перемешивают. Ежедневно готовят свежий реактив. Стабилен до окончания указанного на флаконе срока годности при температуре хранения +2…+8°C,

в) растворяют R3 в 200 мл бидистиллированной воды. Стабилен 4 недели в холодильнике,

г) реактив гемоглобина: растворяют 1 часть реактива гемоглобина в 4 частях бидистиллированной воды. Хранят в защищенном от света месте. Реактив стабилен 6 месяцев.

2. Подготовка пробы к исследованию и проведение реакции

Кровь из вены отбирают в пробирку с гепарином. Берут 0,5 мл гепаринизированной крови, растворяют в 1 мл R3, инкубируют 5 минут, добавляют 1 мл реактива гемоглобина, хорошо перемешивают. Далее из данного образца отбирают 20 мкл пробы, добавляют 1000 мкл Реактива R1 и 40 мкл Кумен R2. Перемешивают пробу, R1 и R2. Определяют начальную оптическую плотность пробы и бланка через 1 минуту и одновременно включают таймер. Определяют оптическую плотность через 1 и 2 минуты.

3. Расчет активности глутатионпероксидазы.

Активность глутатионпероксидазы рассчитывают по следующей формуле:

Ед/л Гемолизата=8412x-ΔA 340 нм/мин.

Перевод в ед/грамм-гемоглобин (ед/г Hg)

Определение активности глутатионредуктазы.

Определение активности глутатионредуктазы в цельной крови проводят на биохимическом полуавтоматическом анализаторе Stat-Fax 1904 plus.

Исследование включает пробоподготовку для получения отмытых эритроцитов, проведения процедуры их лизиса, дальнейшее определение активности глутатионредуктазы в лизате эритроцитов.

Расходные материалы

1. Набор для определения активности глутатионредуктазы (производитель Randox Laboratories LTD, Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom BT 29 4 QY), содержащий: a) R1a бкфер, R1b-субстрат, б) R2-NADPH

2. Физиологический раствор

1. Приготовление реактивов.

1) Растворяют 5 мл R1a в R1в. Стабильно 2 дня в холодильнике.

2) Растворяют 3 мл дистиллированной воды в R2. Стабильно 2 дня в холодильнике.

2. Подготовка пробы к исследованию:

а) берут 0,5 мл цельной крови,

б) центрифугируют 0,5 мл цельной крови при 2000 об/мин в течение 5 минут, после чего аспирируют плазму. К эритроцитам добавляют 3 мл физиологического раствора и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут, процедуру проводят 3 раза,

б) эритроциты лизируют до 0,5 мл бидистиллированной водой. Перемешивают и инкубируют 10 минут при температуре 4^оC.

Получают лизат 0,5 мл.

в) 100 мкл лизата смешивают с 1,9 мл физиологического раствора.

Разведение в 20 раз.

3. Проведение реакции

Далее из данного образца отбирают 40 мкл пробы, добавляют 1000 мкл Реактива R1 и 40 мкл Кумен R2. Перемешивают пробу, R1 и R2. Определяют начальную оптическую плотность пробы и бланка через 1 минуту и одновременно включают таймер. Определяют оптическую плотность через 1 и 2 минуты.

Смешивают и включают секундомер.

4. Расчет активности глутатионредуктазы

а) определяют ΔE=E1-E2-E3-E4-E5 или (E1-E5)/5,

б) активность глутатионредуктазы рассчитывают по следующей формуле:

E/л=4983×(ΔE/5)×20, где 20 - коэффициент разведения,

в) перевод в Ед/грамм-гемоглобин (ед/г Hg)

Для оценки состояния детоксикационной функции организма у работающих в условиях химического комплекса вводят показатель детоксикационной функции организма (ГГО), рассчитываемый по формуле

,

где СОД - активность супероксиддисмутазы в лизатах эритроцитов (ед/г Hg)

ГП - активность глутатионпероксидазы в лизатах эритроцитов (ед/г Hg)

ГР - активность глутатионредуктазы в эритроцитах (ед/г Hg)

Степень нарушения детоксикационной функции оценивают исходя из значения показателя детоксикационной функции, норма значений которого находится в диапазоне значений от 378 до 563 ед/г Hg.

Значение показателя детоксикационной функции выше 563 ед/ г Hg свидетельствует о компенсированном нарушении детоксикационной функции организма работника и требует медикаментозной коррекции. Значение показателя детоксикационной функции ниже 378 ед/г Hg свидетельствует о декомпенсированном нарушении детоксикационной функции организма работников и является плохим прогностическим признаком. Данному работнику необходимо углубленное обследование в условиях стационара с целью ранней диагностики патологии.

При обследовании работников, занятых в условиях химического комплекса, были проведены углубленное гематологическое, биохимическое обследование с определением активности вышеописанных ферментов в эритроцитах, а также фермента гамма-глутамиламинотрансферазы (ГГТ) в сыворотке крови. При изучении состояния антиокислительных процессов в крови у работников было обнаружено, что при наличии у обследуемых эритроцитоза, значение ПD было выше 563 ед/г Hg (р<0,001), при наличии у обследуемых эритроцитопении и увеличения активности ГГТ, значение ПD было ниже 378 ед/г Hg. Если уровень исследуемых показателей находился в пределах референтных значений, значение ПD определялось от 378 до 563 ед/г Hg (р<0,001).

Пример 1. Работник A. Стаж работы в условиях химического комплекса 23 года, возраст 49 лет. Активность супероксиддисмутазы в лизате эритроцитов=1682,0 ед/г Hg, активность глутатионпероксидазы в лизате эритроцитов=68,7 ед/г Hg, активность глутатионредуктазы в лизате эритроцитов=18,1 ед/г Hg. ПD=590. Активность ГГТ=42 ед/л, количество эритроцитов=5,9*10¹² г/л, что выше референтных величин (4-5*10¹² г/л). Значение показателя детоксикационной функции выше 563 ед/г Hg, что характеризует компенсированное нарушение детоксикационной функции организма работника и требует медикаментозной коррекции.

Пример 2. Работник Б. Стаж работы в условиях химического комплекса 15 лет, возраст 37 лет. Активность супероксиддисмутазы в лизате эритроцитов=602,0 ед/г Hg, активность глутатионпероксидазы в лизате эритроцитов=20,7 ед/г Hg, активность глутатионредуктазы в лизате эритроцитов=3,1 ед/г Hg. ПD=208,6. Активность ГГТ=82 ед/л, была выше референтных величин (до 61 ед/л), количество эритроцитов=3,4*10¹² г/л, что ниже референтных величин (4-5*10¹² г/л). Значение показателя детоксикационной функции ниже 378 ед/г Hg, что свидетельствует о нарушении детоксикационной функции организма работников и является плохим прогностическим признаком. Данному работнику необходимо углубленное обследование в условиях стационара с целью ранней диагностики патологии.

Пример 3. Работник В. Стаж работы в условиях химического комплекса 4 года, возраст 28 лет. Активность супероксиддисмутазы в лизате эритроцитов=1358,0 ед/г Hg, активность глутатионпероксидазы в лизате эритроцитов=44,3 ед/г Hg, активность глутатионредуктазы в лизате эритроцитов=7,4 ед/г Hg. ПD=470. Активность ГГТ=34 ед/л, количество эритроцитов=3,4*10¹² г/л, что находится в пределах референтных величин. Значение показателя детоксикационной функции, находящееся в пределах 378-563 ед/г Hg (p<0,001), свидетельствует о том, что детоксикационная функция организма работника находится в норме.