СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ АНАЭРОБНОГО МЕТАБОЛИЗМА ГЛЮКОЗЫ У РАБОТНИКОВ ХИМИЧЕСКОЙ И НЕФТЕХИМИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, и может быть использовано для диагностики нарушения энергетической системы у работников химической и нефтехимической промышленности.

Химическая и нефтехимическая промышленность является ведущей основой экономики и имеет важное общехозяйственное и оборонное значение для развития Российской Федерации [Д.Д. Новиков, Т.Н. Шушунова Проблемы модернизации химического комплекса Республики Башкортостан / Успехи в химии и химической технологии. Том XXVI. 2012. - №6. - С. 82-87].

Химическая и нефтехимическая промышленность - одна из отраслей тяжелой промышленности. На предприятиях химической и нефтехимической отрасли производятся разнообразные виды химической продукции: горно-химическое сырье, продукты основной химии (аммиак, неорганические кислоты, щелочи, минеральные удобрения, содау, хлор, сжиженные газы и др.), синтетические смолы и пластические массы, химические волокна и нити, материалы и изделия из пластических масс и стеклопластиков, лакокрасочные материалы, синтетические красители, химические реактивы, фотохимическая продукция, товары бытовой химии и др. [Е.С. Карпушкин. О некоторых направлениях развития химической промышленности. Транспортное дело России №1, 2011 г. С. 16-19].

В химической индустрии, в т.ч. нефтехимической, насчитывается около 800 крупных и средних промышленных предприятий и более 100 научных и проектно-конструкторских организаций, опытных и экспериментальных заводов общей численностью работающих более 740 тыс. человек. [Г.Х. Яруллина Сценарный подход в инновационном развитии нефтехимического комплекса / Вестник Казанского технологического университета. Том 16. - №17, 2013 г. - С. 269-273].

Вместе с тем, около 39% работающих в химической и нефтехимической промышленностях занято во вредных условиях труда [Э.Т. Валеева. Научное обоснование системы охраны здоровья работников химической промышленности на основе оценки профессионального риска: автореф. дис. … док. мед. наук: - Москва, 2013, 48 с.].

Вредные производственные факторы отрасли воздействуют на органы и системы работников, вызывая развитие различных патологических состояний. У работников возникают нарушения сердечно-сосудистой, энергетической, метаболической систем и других.

Энергообеспечение осуществляется в организме посредством реакций гликолиза, в процессе которого образуется более 30 молекул АТФ. При нарушении последовательности реакций гликолиза в организме у работников развивается дисбаланс в энергетической системе.

Лактат является конечным продуктом анаэробного гликолиза. Лактатдегидрогеназа - гликолитический фермент, обратимо катализирующий отщепление водорода от молекулы молочной кислоты (лактата). Это важнейшая реакция анаэробного метаболизма глюкозы, которая присутствует во многих клетках. Накопление лактата может уменьшить pH крови и снизить концентрацию бикарбоната, что приводит к метаболическому ацидозу [А.А. Кишкун. Биохимические исследования в клинической практике. 2014 г. С. 127-129, 169-171].

Прототипом изобретения является способ диагностики нарушений энергообразования в митохондриях гепатоцитов у подростков, заключающийся в определении в сыворотке крови ферментов аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), и при повышении активности фермента ACT при сохранении нормальной активности ферментов АЛТ, КФК, ЛДГ диагностируют нарушение энергопродуцирующей функции митохондрий гепатоцитов у подростков [патент РФ №2465599, 2012 г.)]. Недостатками данного способа являются его трудоемкость, энергоемкость и требование больших материальных затрат.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа диагностики нарушений энергетической системы у работников химического комплекса при массовых обследованиях.

Технический результат - повышение точности и достоверности наличия нарушений анаэробного метаболизма глюкозы у работников химического и нефтехимического комплекса при массовых обследованиях.

Способ может быть широко использован в медицинских учреждениях для диагностики нарушений анаэробного метаболизма глюкозы у работников химического и нефтехимического комплекса в случае, если работающие предъявляют соответствующие жалобы, для дифференциальной диагностики с другими патологиями.

Предлагаемый способ диагностики нарушений анаэробного метаболизма глюкозы осуществляется следующим образом. Производят забор крови натощак из вены. В сыворотке крови определяют концентрацию лактата и лактатдегидрогеназы.

При увеличении лактата выше 2,1 ммоль/л и снижении лактатдегидрогеназы ниже 225 Е/л диагностируют нарушение анаэробного метаболизма глюкозы у работников химического и нефтехимического комплекса.

Технология: Натощак из вены работника осуществляют забор крови в количестве 5 мл в пробирку, дают отстояться 30 минут при температуре 22-25°C, центрифугируют при 1500 оборотов 15 минут для получения сыворотки.

Определение лактата в сыворотке крови

Определяют ферментативным ультра-фиолетовым тестом с лактатдегидрогеназой с помощью наборов фирмы Human (Германия). В присутствии НАД лактат конвертируется лактатдегидрогеназой. При этом образуется НАДН, который измеряется при 340 нм. Поглощение образуемого НАДН пропорционально концентрации лактата в образце.

Приготовливают монореагент: смешивают 4 части содержимого флакона №1 с буфером с 1 частью содержимого флакона №2 с НАД. Стабильность монореагента 2 недели при температуре 2-8°C.

Берут 15 мкл плазмы крови, добавляют 1000 мкл монореагента, смешивают и инкубируют 5 минут при температуре 37°C. Измеряют поглощение А против холостой пробы не позднее чем через 30 минут после смешивания. В холостой пробе вместо плазмы используют дистиллированную воду. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. По величине измеренного поглощения вычисляют А и умножают на фактор, равный 144,4. Получают содержание лактата в мг/дл. Коэффициент пересчета в ммоль/л равен 0,1109.

Определение лактадегидрогеназы в сыворотке крови

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) - фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту и участвующий в одном из конечных этапов превращения глюкозы с образованием молочной кислоты. ЛДГ содержится практически во всех органах и тканях человека.

Активность сывороточной ЛДГ возрастает у больных, страдающих анемией, обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитами, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого.

Принцип метода определения ЛДГ основан на отличии спектров поглощения восстановленной (НАДН) и окисленной (НАД) форм никотинамидадениндинуклеотида с помощью наборов фирмы Human (Германия). При 340 нм НАДН имеет максимальное поглощение, тогда как НАД не имеет поглощения при данной длине волны. Таким образом, при превращении НАДН в НАД происходит уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 340 нм.

Схема определения активности ЛДГ:

Приготовливают рабочий реагент: смешивают содержимое флакона с субстратом с содержимым флакона с буфером. Тщательно перемешивают. Рабочий реагент стабилен в течение 3 недель при температуре 2-8°C.

Берут 10 мкл сыворотки крови, добавляют 1000 мкл рабочего реагента, тщательно перемешивают и запускают секундомер, инкубируют ровно 1 минуту при температуре 37°C. Измеряют оптическую плотность 3 раза с интервалом 1 минута. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. Вычисляют среднее значение А и умножают на фактор равный 16030. Получают содержание ЛДГ в Е/л.

Было проведено биохимическое исследование сыворотки крови, взятой натощак у обследованных с жалобами на общую слабость, головную боль, раздражительность, расстройства сна, на подверженность инфекциям, быструю утомляемость. Результаты проведенного исследования показали, что у работников с наличием клинических признаков нарушений в энергетической системе, чаще по сравнению с работниками без признаков нарушений в энергетической системе, обнаруживалось изменение показателей ЛДГ и лактата (p<0,001).

По результатам проведенных санитарно-гигиенических исследований на предприятии нефтехимического производства (г. Уфа, нефтехимический комплекс) установлено, что имеет место наличие комплекса вредных производственных факторов рабочей среды и трудового процесса (химический фактор, физический фактор (воздействие шума, физических нагрузок, микроклимата и др.), тяжесть и напряженность трудового процесса. Условия труда работников основной профессии по уровню вредных производственных факторов рабочей среды и трудового процесса соответствовали вредному классу условий труда 3 (класс 3.1-3.3). Работники данной группы были отнесены к основной группе. Обследованный контингент был представлен мужчинами по профессии «аппаратчик», средний возраст которых составил 37,4±1,3 года, средний стаж работы - 14,6±0,7 года.

Условия труда работников вспомогательной профессии соответствовали допустимому классу условий труда (класс 2) (согласно Руководству Р 2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда»). Работники данной группы были отнесены к группе сравнения. Группы были сопоставимы по полу, возрасту и стажу работы.

Для исключения других причин изменения лактата и лактатдегидрогеназы в сыворотке крови были проведены стандартные клинические и лабораторные методы обследования. Работникам производства был проведен осмотр согласно Приказу МЗ и CP РФ от 12 апреля 2011 г. N 302н «Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ». Осмотр был проведен врачом - терапевтом, дерматовенерологом, неврологом, психиатром, офтальмологом, оториноларингологом, в необходимых случаях проведена консультация проктолога, кардиолога, ортопеда, хирургом и других специалистов. Также проведен анализ сывороточного железа и ферритина; электрокардиография, фиброгастродуоденоскопия, ультразвуковые исследования брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза, ирригография. При превышении одного лабораторного показателя на величину, превышающую одну сигму, и нарушений, выявленных у специалистов, биохимическое обследование (определение лактата и лактатдегидрогеназы работнику не проводились).

В связи с этим нами были сравнены показатели лактата и лактатдегидрогеназы у работников указанных групп.

По результатам проведенных биохимических исследований установлено, что у работников основной группы, занятой на производстве, в сыворотке крови, в отличие от работников группы сравнения, достоверно чаще наблюдается изменение показателей лактата и лактатдегидрогеназы (p<0,001). Необходимо отметить, что у работников основной группы в 100% случаев было отмечено снижение лактатдегидрогеназы относительно данных референтных значений (ниже 225 ммоль/л) и увеличение лактата относительно референтных значений (выше 2,1 ммоль/л), в то время как у работников группы сравнения были выявлены значения показателей лактата и лактатдегидрогеназы, находящиеся в пределах референтных значений, и значения, выходящие за пределы референтных значений в другую сторону.

Предлагаемый способ иллюстрирован следующим клиническим материалом.

Пример 1. Работник С., стаж работы - 11 лет, возраст - 34 года. Работник предъявлял жалобы на общую слабость, головную боль, раздражительность, подъемы артериального давления, расстройства сна, на подверженность инфекциям, быструю утомляемость.

Натощак из вены работника осуществляют забор крови в количестве 5 мл в пробирку, дают отстояться 30 минут при температуре 22-25°C, центрифугируют при 1500 оборотов 15 минут для получения сыворотки.

Определяют лактат в сыворотке крови ферментативным ультрафиолетовым тестом с лактатдегидрогеназой с помощью наборов фирмы Human (Германия). В присутствии НАД лактат конвертируется лактатдегидрогеназой. При этом образуется НАДН, который измеряется при 340 нм. Поглощение образуемого НАДН пропорционально концентрации лактата в образце. Приготовливают монореагент: смешивают 4 части содержимого флакона №1 с буфером с 1 частью содержимого флакона №2 с НАД. Стабильность монореагента 2 недели при температуре 2-8°C. Берут 15 мкл плазмы крови, добавляют 1000 мкл монореагента, смешивают и инкубируют 5 минут при температуре 37°C. Измеряют поглощение А против холостой пробы не позднее чем через 30 минут после смешивания. В холостой пробе вместо плазмы используют дистиллированную воду. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. По величине измеренного поглощения вычисляют А и умножают на фактор, равный 144,4. Получают содержание лактата в мг/дл. Коэффициент пересчета в ммоль/л равен 0,1109.

Определяют лактадегидрогеназу в сыворотке крови_с помощью наборов фирмы Human (Германия). При 340 нм НАДН имеет максимальное поглощение, тогда как НАД не имеет поглощения при данной длине волны. Таким образом, при превращении НАДН в НАД происходит уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 340 нм.

Схема определения активности ЛДГ:

Приготавливают рабочий реагент: смешивают содержимое флакона с субстратом с содержимым флакона с буфером. Тщательно перемешивают. Рабочий реагент стабилен в течение 3 недель при температуре 2-8°C. Берут 10 мкл сыворотки крови, добавляют 1000 мкл рабочего реагента, тщательно перемешивают и запускают секундомер, инкубируют ровно 1 минуту при температуре 37°C. Измеряют оптическую плотность 3 раза с интервалом 1 минута. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. Вычисляют среднее значение А и умножают на фактор, равный 16030. Получают содержание ЛДГ в Е/л.

Уровень лактата в сыворотке крови 4,0 ммоль/л, активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови 190 Е/л.

Предполагаемое нарушение анаэробного метаболизма глюкозы у работников химической и нефтехимической промышленности подтвердилось. В дальнейшем необходимы профилактические мероприятия.

Пример 2. Работник В., стаж работы - 10 лет, возраст - 33 года.

Работник предъявлял жалобы на расстройства сна, общую слабость, головную боль, раздражительность, на подверженность инфекциям, быструю утомляемость.

Натощак из вены работника осуществляют забор крови в количестве 5 мл в пробирку, дают отстояться 30 минут при температуре 22-25°C, центрифугируют при 1500 оборотов 15 минут для получения сыворотки.

Определяют лактат в сыворотке крови ферментативным ультрафиолетовым тестом с лактатдегидрогеназой с помощью наборов фирмы Human (Германия). В присутствии НАД лактат конвертируется лактатдегидрогеназой. При этом образуется НАДН, который измеряется при 340 нм. Поглощение образуемого НАДН пропорционально концентрации лактата в образце. Приготовливают монореагент: смешивают 4 части содержимого флакона №1 с буфером с 1 частью содержимого флакона №2 с НАД. Стабильность монореагента 2 недели при температуре 2-8°C. Берут 15 мкл плазмы крови, добавляют 1000 мкл монореагента, смешивают и инкубируют 5 минут при температуре 37°C. Измеряют поглощение А против холостой пробы не позднее чем через 30 минут после смешивания. В холостой пробе вместо плазмы используют дистиллированную воду. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. По величине измеренного поглощения вычисляют А и умножают на фактор, равный 144,4. Получают содержание лактата в мг/дл. Коэффициент пересчета в ммоль/л равен 0,1109.

Определяют лактадегидрогеназу в сыворотке крови с помощью наборов фирмы Human (Германия). При 340 нм НАДН имеет максимальное поглощение, тогда как НАД не имеет поглощения при данной длине волны. Таким образом, при превращении НАДН в НАД происходит уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 340 нм.

Схема определения активности ЛДГ:

Приготавливают рабочий реагент: смешивают содержимое флакона с субстратом с содержимым флакона с буфером. Тщательно перемешивают. Рабочий реагент стабилен в течение 3 недель при температуре 2-8°C. Берут 10 мкл сыворотки крови, добавляют 1000 мкл рабочего реагента, тщательно перемешивают и запускают секундомер, инкубируют ровно 1 минуту при температуре 37°C. Измеряют оптическую плотность 3 раза с интервалом 1 минута. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. Вычисляют среднее значение А и умножают на фактор, равный 16030. Получают содержание ЛДГ в Е/л.

Уровень лактата в сыворотке крови 2,0 ммоль/л, лактатдегидрогеназы в сыворотке крови 190 Е/л.

Предполагаемое нарушение анаэробного метаболизма глюкозы у работников химической и нефтехимической промышленности не подтвердилось.

Пример 3. Работник П., стаж работы - 9 лет, возраст - 31 год. Работник предъявлял жалобы на общую слабость, головную боль, раздражительность, расстройства сна, быструю утомляемость.

Натощак из вены работника осуществляют забор крови в количестве 5 мл в пробирку, дают отстояться 30 минут при температуре 22-25°C, центрифугируют при 1500 оборотов 15 минут для получения сыворотки.

Определяют лактат в сыворотке крови ферментативным ультрафиолетовым тестом с лактатдегидрогеназой с помощью наборов фирмы Human (Германия). В присутствии НАД лактат конвертируется лактатдегидрогеназой. При этом образуется НАДН, который измеряется при 340 нм. Поглощение образуемого НАДН пропорционально концентрации лактата в образце. Приготовливают монореагент: смешивают 4 части содержимого флакона №1 с буфером с 1 частью содержимого флакона №2 с НАД. Стабильность монореагента 2 недели при температуре 2-8°C. Берут 15 мкл плазмы крови, добавляют 1000 мкл монореагента, смешивают и инкубируют 5 минут при температуре 37°C. Измеряют поглощение А против холостой пробы не позднее чем через 30 минут после смешивания. В холостой пробе вместо плазмы используют дистиллированную воду. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. По величине измеренного поглощения вычисляют А и умножают на фактор, равный 144,4. Получают содержание лактата в мг/дл. Коэффициент пересчета в ммоль/л равен 0,1109.

Определяют лактадегидрогеназу в сыворотке крови с помощью наборов фирмы Human (Германия). При 340 нм НАДН имеет максимальное поглощение, тогда как НАД не имеет поглощения при данной длине волны. Таким образом, при превращении НАДН в НАД происходит уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 340 нм.

Схема определения активности ЛДГ:

Приготавливают рабочий реагент: смешивают содержимое флакона с субстратом с содержимым флакона с буфером. Тщательно перемешивают. Рабочий реагент стабилен в течение 3 недель при температуре 2-8°C. Берут 10 мкл сыворотки крови, добавляют 1000 мкл рабочего реагента, тщательно перемешивают и запускают секундомер, инкубируют ровно 1 минуту при температуре 37°C. Измеряют оптическую плотность 3 раза с интервалом 1 минута. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. Вычисляют среднее значение А и умножают на фактор, равный 16030. Получают активность ЛДГ в Е/л.

Уровень лактата в сыоротке крови 4,0 ммоль/л, лактатдегидрогеназы в сыворотке крови 487 Е/л.

Предполагаемое нарушение анаэробного метаболизма глюкозы у работников химической и нефтехимической промышленности не подтвердилось.

Пример 4. Работник Н., стаж работы - 11 лет, возраст - 34 года.

Работник предъявлял жалобы на быструю утомляемость, общую слабость, головную боль, раздражительность, расстройства сна, на подверженность инфекциям.

Натощак из вены работника осуществляют забор крови в количестве 5 мл в пробирку, дают отстояться 30 минут при температуре 22-25°C, центрифугируют при 1500 оборотов 15 минут для получения сыворотки.

Определяют лактат в сыворотке крови ферментативным ультрафиолетовым тестом с лактатдегидрогеназой с помощью наборов фирмы Human (Германия). В присутствии НАД лактат конвертируется лактатдегидрогеназой. При этом образуется НАДН, который измеряется при 340 нм. Поглощение образуемого НАДН пропорционально концентрации лактата в образце. Приготовливают монореагент: смешивают 4 части содержимого флакона №1 с буфером с 1 частью содержимого флакона №2 с НАД. Стабильность монореагента 2 недели при температуре 2-8°C. Берут 15 мкл плазмы крови, добавляют 1000 мкл монореагента, смешивают и инкубируют 5 минут при температуре 37°C. Измеряют поглощение А против холостой пробы не позднее чем через 30 минут после смешивания. В холостой пробе вместо плазмы используют дистиллированную воду. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. По величине измеренного поглощения вычисляют А и умножают на фактор, равный 144,4. Получают содержание лактата в мг/дл. Коэффициент пересчета в ммоль/л равен 0,1109.

Определяют лактадегидрогеназу в сыворотке крови с помощью наборов фирмы Human (Германия). При 340 нм НАДН имеет максимальное поглощение, тогда как НАД не имеет поглощения при данной длине волны. Таким образом, при превращении НАДН в НАД происходит уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 340 нм.

Схема определения активности ЛДГ:

Приготавливают рабочий реагент: смешивают содержимое флакона с субстратом с содержимым флакона с буфером. Тщательно перемешивают. Рабочий реагент стабилен в течение 3 недель при температуре 2-8°C. Берут 10 мкл сыворотки крови, добавляют 1000 мкл рабочего реагента, тщательно перемешивают и запускают секундомер, инкубируют ровно 1 минуту при температуре 37°C. Измеряют оптическую плотность 3 раза с интервалом 1 минута. Длина волны: 340 нм, оптический путь 1 см. Вычисляют среднее значение А и умножают на фактор, равный 16030. Получают содержание ЛДГ в Е/л.

Уровень лактата в сыворотке крови 2,6 ммоль/л, активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови 280 Е/л.

Предполагаемое нарушение анаэробного метаболизма глюкозы у работников химической и нефтехимической промышленности не подтвердилось.