Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ШЕЙКИ МАТКИ У ЖЕНЩИН, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, гинекологии, биофизике, и касается способа оценки риска развития папилломавирус-ассоциированного канцерогенеза шейки матки.

Несмотря на широкое применение современных методов диагностики, проблема смертности от рака шейки матки (РШМ) остается актуальной [Роговская С.И. Папилломавирусная инфекция у женщин и патология шейки матки: руководство для практикующего врача. - М.: Гэотар-Медиа, 2005; Дмитриев Г.А., Биткина О.А. Папилломавирусная инфекция. - М.: Медицинская книга, 2006. -80 с]. Заболеваемость раком шейки матки растет и занимает второе место по распространенности среди онкологических заболеваний в мире и первое место среди причин женской смертности от рака в развивающихся странах. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется около 500000 новых случаев и более 250000 смертей от данного заболевания. Средний возраст больных по данным отечественной и зарубежной литературы колеблется от 38 до 50 лет. Как отмечают большинство исследователей, выявляемость начальных стадий рака шейки матки составляет от 42% до 58%. В возрасте 35-40 лет рак шейки матки является одной из основных причин смерти от злокачественных опухолей [Эпидемиологическая ситуация по папилломавирусной инфекции в США (выдержки из рекомендаций Консультативного совета по вакцинальной практике США, опубликованных в MMWR №56, март 2007 г.) // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2007. №2. С.30-35]. За последние десятилетия это онкологическое заболевание существенно помолодело, и его пик приходится на активный репродуктивный возраст фертильных женщин. По экспертным оценкам стоимость комплексного лечения одного случая РШМ составляет около 1,1 млн руб. [Лялина Л.В. Эпидемиологические закономерности злокачественных новообразований, ассоциированных с хроническими вирусными инфекциями, и развитие системы эпидемиологического надзора: Автореф. дис. докт. мед. наук. - СПб., 2005-45 с.; Киселев В.И., Киселев О.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М., 2003. - 90 с.; Сафронникова Н.Р. Мерабишвили В.М. Профилактика вирусзависимых онкологических заболеваний. Диагностика и лечение папилломавирусной инфекции: пособие для врачей. - СПб., 2007. -34 с]. В целом проблема ранней диагностики РШМ и оценки риска развития канцерогенеза шейки матки далека от разрешения.

В настоящее время результаты диагностики и прогнозирования течения папилломавирус-ассоциированной трансформации ткани шейки матки на сегодняшний день не удовлетворяют ни врача, ни пациента. Существующие на данные момент способы оценки риска развития канцерогенеза шейки матки относятся к двум группам:

- Кольпоскопическое исследование, позволяющее морфологически оценить степень изменения тканей. При данном методе возможна достаточно поздняя констатация трансформации тканей шейки матки [Винокуров В.Л. Рак шейки матки, тела матки и яичников: итоги и перспективы исследований в ЦНИРРИ Минздрава РФ // Вопросы онкологии. - 2003. - Т. 49, №5. - С.656-662; Гилязутдинова З.Ш., Михайлова М.К. Онкогинекология // Руководство для врачей. - М.: МЕДпресс, 2000. - С.384; Козаченко В.П. Современное состояние проблемы рака шейки матки / Заболевания шейки матки, влагалища и вульвы / Под ред. В.Н. Прилепской. - М.: МЕДпресс, 2000. - С.133-139].

- Определение инфицированности вирусами папилломы человека (ВПЧ) и типов ВПЧ (низкоонкогенные, среднеонкогенные и высокоонкогенные типы) методом ПЦР. Однако у части инфицированных женщин, в том числе высокоонкогенными типами вирусов папилломы человека, инфекционное заболевание проходит латентно и со временем вирус элиминируется из организма. В то же время доказано, что ассоциация нескольких типов ВПЧ, включающая не только высокоонкогенные типы, но и другие типы ВПЧ может способствовать более быстрому развитию онкогенеза шейки матки [Киселев В.И., Киселев О.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М., 2003. - 90 с.].

Известен способ, учитывающий возможность элиминации трансформированных клеток за счет апоптоза, по патенту РФ №2208789, описывающий прогнозирование клинического течения увеальной меланомы на основе изучения активности маркера апоптоза р53, автор Лихванцева В.Г. Данный способ предлагает учет данного маркера в прогнозе первичной злокачественной опухоли, занимающей первое место по частоте среди внутриглазных новообразований.

Известен способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы по патенту РФ №2208790 автор Лихванцева В.Г., который основан на исследовании на основе активности маркера апоптоза Вах.

Недостатками вышеназванных способов прогнозирования течения онкологического заболевания является оценка отдельных показателей, при этом отсутствует системный анализ происходящих в организме процессов, влияющих на известные в данное время патогенетические звенья канцерогенеза. В вышеназванных патентах не предложены способы оценки риска развития канцерогенеза, данные методы касаются только возможностей прогнозирования течения уже сформировавшейся опухоли. Кроме того, способы прогнозирования клинического течения онкологического заболевания относятся к другой локализации патологического процесса и неприменимы в области гинекологии.

Задача изобретения состоит в ранней оценке риска развития канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы.

Сущность изобретения состоит в ранней оценке степени риска канцерогенеза шейки матки у женщин с выявленной методами ПЦР инфекцией, вызванной семейством вирусов папилломы.

Существенным отличием предлагаемого способа оценки степени риска развития канцерогенеза шейки матки является системный подход, учитывающий разные звенья патогенеза рака, в том числе тип вируса, интенсивность радикал-зависимого повреждения тканей шейки матки в процессе хронической инфекции высокого онкогенного риска и способности организма к элиминации раковых и вирус-инфицированных клеток за счет апоптоза. Преимуществом от всех известных аналогов является также возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развитие РШМ при выявленной предрасположенности или при наличии одного из факторов риска.

Оценка риска канцерогенеза шейки матки проводится на основании исследования типов ВПЧ, показателей апоптоза в тканях биопата шейки матки (sFAS, TRAIL), генетических особенностей экспрессии генов, регулирующих процессы апоптоза (sFAS, TRAIL), а также процессов радикалообразования (активность миелопероксидазы, уровень нитрат-нитритов, общая антиоксидантная емкость ткани по реакции Фентона), измеряемых в тканях биоптата, взятых при кольпоскопии из шейки матки.

Сущность изобретения состоит в систематизации и учете различных факторов риска развития канцерогенеза шейки матки. При этом рассчитывают суммарный коэффициент риска по формуле K=K₁+K₂+K₃, где

K₁ - коэффициент инфицированности вирусами папилломы человека. K₁=0 - в случае отсутствия ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ) при ПНР исследовании цервикального эпителия.

K₁=1 - в случае обнаружения ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ) при ПЦР исследовании цервикального эпителия.

К₂ - коэффициент радикального повреждения тканей при ВПЧ, вычисляется следующим образом:

K₂=k_2a+k_2b+k_2c, где

К_2а показатель активности миелопероксидазы в тканях, взятых при кольпоскопическом исследовании:

К_2а=0 - в случае выявления значений меньше 0,054±0,005 ммоль/грамм белка;

К_2а=1 - в случае выявления значений >0,054±0,005 ммоль/грамм белка.

Получение гомогенатов. Образец ткани (биоптат) тщательно отмывали от эритроцитов (в 0,9% NaCl). К образцу весом 1-3 мг добавляли 600 мкл К-фосфатного буфера и растирали в ручном гомогенизаторе Поттера до получение однородной суспензии. Гомогенат центрифугировали в течение 30 минут при 900g (3000 об/мин, центрифуга ОПН-3 без охлаждения) и для дальнейших анализов отбирали прозрачный супернатант.

Оценка содержания белка по Лоури. Для оценки содержания белка в супернатанте гомогената использовали метод Лоури, в качестве калибратора использовали бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma). К 20 мкл образца добавляли 180 мкл воды, инкубировали в течение 10 минут с 1 мл реактива Лоури, а затем добавляли 100 мкл реактива Фолина (1:1). Через 40 минут измеряли поглощение пробы при 750 нм.

Оценка активности миелопероксидазы (МПО). Активность МПО оценивали в супернатантах гомогенатов на основании реакции с ортодианизидином. Аликвоты супертанатнов (50 мкл) смешивали с 50 мкл H₂O и добавляли 100 мкл реакционной смеси, содержащей 100 мкг/мл о-дианизидина и 80 мкг/мл H₂O₂ в 0,1М натрий-цитратном буфере, рН 5,5. Пробы инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 1 мл 35%-ной ортофосфорной кислоты. Измеряли поглощение проб при 560 нм и рассчитывали активность МПО с использованием коэффициента экстинкции 20040 М^-1см^-1 [Andrews Р.С., Parens С, Krinsky N.I. Comparison of myeloperoxidase with respect to catalysis, regulation and bactericidal activity// Arch.Biochem.Biophys., 1984; 228: 439-442].

k_2b - показатель активности оксид азот-зависимого окисления тканей;

k_2b=0, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов<120,0±10,0 микромоль/г белка;

k_2b=1, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов>120,0±10,0 микромоль/г белка.

Оценка содержания нитратов и нитритов. 80 мкл образца вносили в лунку 96-луночного планшета, затем вносили по 10 мкл раствора нитрат-редуктазы и кофактора и инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл реактива Грисса (А), аккуратно перемешивали и через 5 минут вносили 50 мкл реактива Грисса (Б). Смесь перемешивали, оставляли на 10 минут при комнатной температуре и затем измеряли поглощение при 540 нм. Для расчета концентрации нитратов и нитритов использовали калибровочную кривую, полученную по той же схеме с использованием раствора нитрата. Для проведения измерений применяли набор "Nitrate/nitrite Assay Kit Colorimetric" Sigma (23479).

k_2c - показатель общей антиоксидантной емкости ткани гомогената шейки матки;

k_2c=0, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона более (≥) чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл;

k_2c=1, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона менее чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл.

Оценка эффектов гомогенатов образцов в системе Фентона. Анализ проводили в кювете люминометра объемом 1 мл, в режиме постоянного перемешивания и непрерывной регистрации. В среду измерений (0,01М К-фосфатный буфер, рН 7,4, добавляли раствор FeS04 (17,7 мкМ), образец (20) и люминол (0,2 мМ). Реакцию Фентона инициировали внесением H₂O₂ (17,7 мкМ) через диспенсер и регистрировали интенсивность вспышки. Контролем служили пробы, не содержащие биологический образец.

K₃ - коэффициент экспрессии генов апоптоза в тканях биопататов шейки матки (FAS, TRAIL), вычисляется следующим образом:

K₃=k_3a+k_3b

k_3a=0 - в случае выявления нормального показателя экспрессии FAS.

k_3a=1 - в случае снижения уровня экспрессии FAS относительно уровня доноров

более чем на 25%.

k_3b=0 - в случае выявления нормального показателя экспрессии TRAIL.

k_3b=1 - в случае снижения уровня экспрессии TRAIL относительно уровня доноров более чем на 25%.

Оценку экспрессии генов апоптоза (sFAS, TRAIL) проводили методом количественного Real-time ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycler IQ (BioRad), в соответствии с основными рекомендациями протокола EAC (European Anti Cancer Program, 2003). Оценка экспрессии проводилась в три этапа: на первом этапе проводили выделение РНК из тканей биоптата пациенток.

Требования к биоптатам. Для анализа экспрессии генов могли использоваться свежие или замороженные ткани. Размер ткани должен был быть 4-5 мм - для оптимальной заморозки и пропитывания (в случае необходимости) стабилизирующим раствором RNA-later (Ambion). Обработку RNA-later проводили сразу после взятия. Замороженный биоптат хранили при температуре -20°С не более 3 месяцев. Повторное замораживание было недопустимо.

Для выделения РНК из свежих или замороженных тканей использовали iPrepPureLink™ Total RNA Kit, основанный на методике P. Chomczynsky, N. Sacchi (метод кислой гуанидин-тиоцинат-фенол-хлороформ-экстракции). К 10 млг гомогената образца ткани добавляли 100 мкл лизирующего буфера, затем центрифугировали при 12 000g 5 минут при комнатной температуре. Супернатант переносили в iPrep™ Sample Tube и производили выделение РНК согласно инструкции к iPrepPureLink™ Total RNA Kit (Invitrogen, USA).

На втором этапе с помощью реакции обратной транскрипции синтезировали копии ДНК на матрице мРНК. Для синтеза кДНК использовали комплект реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Для этого в пробирку с RT-mix вносили 5 мкл RT-G-mix-1, тщательно перемешивали на вортексе, осаждали капли с крышки кратковременным центрифугированием. К полученному раствору добавляли 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировали 5 раз и перемешивали на вортексе. Вносили в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. Используя наконечники с аэрозольным барьером, добавляли по 10 мкл РНК-пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешивали пипетированием. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР разводили в 2 раза ДНК-буфером. Готовый препарат кДНК использовали либо сразу для ПЦР, либо замораживали и хранили при -68°С. Не допускали хранения необработанных образцов кДНК более 3 месяцев.

На третьем этапе проводили полимеразную цепную реакцию на амплификаторе. ПЦР-амплификация была выполнена в соответствии с методикой, предложенной Gelder. В работе были использованы пары праймеров генов апоптоза sFAS, TRAIL. В качестве контрольного (housekeeping) гена использовали ген β2 микроглобулина ф2М). Экспрессия генов sFAS, TRAIL и β2 микроглобулина определялась в виде числа копий транскрипта. Количество копий в исследуемых образцах определяли по отношению к стандартной калибровочной кривой, построение которой производилось с помощью прибора Real-time ПЦР на основании серии 10-кратных разведений плазмиды с известным количеством копий в 1 мкл. Уровень экспрессии исследуемых генов рассчитывали относительно контроля, используя 2^-ΔΔCt, метод позволяет оценить во сколько раз изменяется экспрессия изучаемого гена в пораженной ткани по сравнению с непораженной тканью. ΔΔCt рассчитывали как ΔΔCt=ΔCt (пораженная ткань)- ΔCt (непораженная ткань), где каждое значение ΔCt=ΔCt (исследуемый ген)- ΔCt ф2 микроглобулин). Отрицательный контроль, необходимый для определения контаминации, содержал все компоненты для ПЦР кроме матрицы ДНК (ОКП). Положительный контроль, использованный для оценки эффективности работы реактивов, содержал все компоненты для ПЦР и контрольные ДНК-матрицы (ПКП).

На завершающем этапе проводили вычисление суммарного коэффициента риска развития канцерогенеза шейки матки: K=K₁+K₂+K₃.

Если суммарный коэффициент K<3, то уровень риска канцерогенеза низкий, если K≥3, то уровень риска канцерогенеза высокий.

Способ позволяет определить степень риска развития канцерогенеза шейки матки у клинически здоровых женщин (но инфицированных ВПЧ), а также при выявленной патологии шейки матки с целью прогноза заболевания и мониторинга эффективности проводимой профилактики и терапии.

Предлагаемый способ прогнозирования риска канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы человека, осуществляют следующим образом.

- При кольпоскопическом исследовании пациенток выявляют женщин с признаками вирусной инфекции и проводят гистологическое исследование биоптатов, а также отправляют материал на выявление ВПЧ-инфекции (с определением типа вируса).

- По данным ПЦР анализа с выявлением типа ВПЧ-инфекции вычисляют первую составляющую суммарного коэффициента риска: Ki=l при выявлении ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ); Ki=0 при отсутствии ВПЧ 16,18 типов.

- Для вычисления коэффициента радикального повреждения тканей исследуют образцы тканей биоптатов. Биоптаты вручную гомогенизируют, определяют количество белка по Лоури и используют для исследования:

- активности миелопероксидазы (k_2a-k_2a=0 - в случае выявления значений <0,054±0,005 ммоль/грамм белка; k_2a=1 - в случае выявления значений >0,054±0,005 ммоль/грамм белка);

- концентрации нитрат-нитритов в тканях (k_2b=0, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов <120,0±10,0 микромоль/г белка; k_2b=1, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов >120,0±10,0 микромоль/г белка).

- Определения общей антиоксидантной емкости ткани гомогената шейки матки (k_2c=0, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона более (>) чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл; k_2c=1, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона менее чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл).

- Вычисляют вторую составляющую суммарного риска K₂=k_2a+k_2b+k_2c, демонстрирующую активность радикальной нагрузки в тканях шейки матки.

- Проводят оценку экспрессии генов апоптоза sFAS и TRAIL в тканях биоптата шейки матки методом количественного Real-time ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycler IQ (BioRad), в соответствии с основными рекомендациями протокола EAC (European Anti Cancer Program, 2003). По результатам вычисляют третью составляющую суммарного коэффициента риска - K₃=k_3a+k_3b (k_3a=0 - в случае выявления нормальный показателей экспрессии генов FAS, k3a=1 - в случае снижения уровня экспрессии FAS относительно уровня доноров более чем на 25%; k_3b=0 - в случае выявления нормальный показателей экспрессии TRAIL, k_3b=1 - в случае снижения уровня экспрессии TRAIL относительно уровня доноров более чем на 25%).

- Вычисляют суммарный коэффициент риска развития рака шейки матки у пациентки K=K₁+K₂+K₃.

- При выявлении значений выше 3 пациентку выделяют в группу риска и назначают курс терапии ВПЧ инфекции и профилактики рака шейки матки.

Пример 1. Пациентка 35 лет. Диагноз - ВПЧ-инфекция 16, 18 типа. При кольпоскопическом исследовании выявлены изменения шейки матки (лейкоплакия). Проведено исследование радикальной нагрузки в ткани биоптата шейки матки и исследована экспрессия генов апоптоза (FAS, TRAIL). Суммарный коэффициент риска=5. Больная отнесена в группу высокого риска развития канцерогенеза. Назначены укороченные интервалы между визитами к врачу. Назначена противовирусная терапия и иммунотерапия.

Пример 2. Пациентка 38 лет. Диагноз - ВПЧ-инфекция 10, 13 типа. Проведено исследование радикальной нагрузки в ткани шейки матки и оценка экспрессии генов апоптоза (FAS, TRAIL). Суммарный коэффициент риска=2. Больная отнесена в группу низкого риска развития канцерогенеза. Больной предложены визиты к врачу 1 раз в год. Наблюдение на протяжении 8 лет не выявило патологий шейки матки.

Таким образом, предлагаемый способ оценки риска развития канцерогенеза шейки матки позволяет прогнозировать течение заболевания и своевременно назначать адекватное лечение.

Преимуществом от всех известных аналогов является возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развитие рака шейки матки при выявленной предрасположенности или при наличии факторов риска. Также возможно применение данного метода у пациентов с выявленной патологией шейки матки с целью прогноза заболевания и мониторинга эффективности проводимой терапии.