Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ К-АНТИГЕНА Streptococcus pneumoniae ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ШТАММОВ ПНЕВМОКОККОВ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Изобретение относится к медицине, в частности, к клинической микробиологии и касается способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков.

Streptococcus pneumoniae является причиной многих серьезных инвазивных и неинвазивных заболеваний. Частота встречаемости такой патологии, возрастающая резистентность возбудителя к антибактериальным препаратам обуславливают актуальность проблемы разработки эффективных профилактических препаратов.

В настоящее время известно более 90 серотипов Streptococcus pneumoniae. Определение серотипа возможно при наличии соответствующего доступного инструмента, каковым являются диагностические пневмококковые сыворотки.

В последнее время появились сообщения об определении К-антигена Streptococcus pneumoniae методом ПЦР, для чего необходимо соответствующее оборудование и другие материалы.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ типирования пневмококков по К-антигену в реакции «набухания» капсулы с использованием коммерческих препаратов, выпускаемых в Дании (State Serum Institute). Определение К-антигена проходит в несколько этапов: использование поливалентных, затем типовых и групповых сывороток. После определения группы для установления К-типа необходимо использовать факторные сыворотки. Метод трудоемок, требует микроскопии, при этом довольно субъективен.

(Erna Lund Laboratory Diagnosis of mococcus Infections Bull. Wld Hlth Org, 1960, 23, 5-13)

Задачей изобретения является разработка быстрого и точного способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков на территории Российской Федерации. Одним из важных условий решения этой задачи является осуществление мониторинга циркулирующих штаммов на разных территориях в различные периоды, поскольку иммунитет при пневмококковых инфекциях типоспецифический.

Техническим результатом является сокращение трудозатрат, снижение трудоемкости, простота, объективность оценки результата в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе.

Для достижения указанного технического результата в способе определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием определенного набора диагностических агглютинирующих пневмококковых сывороток, состоящего из 4 пуловых сывороток, в составе которых содержатся следующие антитела к К-антигенам, в первой из которых содержатся антитела к К-антигенам: 23F, 19F, 6A, 7F, 4, 14, во второй пуловой сыворотке: 19F, 18C, 9V, 6B, 4, 5, 14, в третьей пуловой сыворотке: 6A, 9V, 19A, 1, 4, 5, 14, в четвертой пуловой сыворотке: 7F, 6B, 1, 3, 5, 14, на стекло наносят по капле каждой из указанных сывороток и одну каплю 0,9% раствора натрия хлорида для контроля, затем в каждую каплю сыворотки вносят небольшое количество исследуемой культуры и тщательно растирают, для определения К-антигена используют следующую тест-систему: положительный результат или выраженная реакция агглютинации в 1 пуловой сыворотке указывает на наличие К-антигена типа 23F, положительный результат в 1 и 2 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 19F, положительный результат в 1 и 3 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 6А, положительный результат в 1 и 4 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 7F, положительный результат во 2 пуловой сыворотке указывает на наличие К-антигена типа 18C, положительный результат во 2 и 3 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 9V, положительный результат во 2 и 4 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 6B, положительный результат в 3 пуловой сыворотке указывает на наличие К-антигена типа 19A, положительный результат в 3 и 4 пуловых сыворотках указывает на наличие K-антигена типа 1, положительный результат в 4 пуловой сыворотке указывает на наличие К-антигена типа 3, положительный результат в 1, 2 и 3 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 4, положительный результат во 2, 3 и 4 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 5, положительный результат в 1, 2, 3 и 4 пуловых сыворотках указывает на наличие К-антигена типа 14.

Изобретения иллюстрируются на следующих примерах.

Пример 1.

Поступивший на исследование клинический материал (мокрота, отделяемое из среднего уха, промывные воды бронхов, СМЖ и др.) засевают на чашки Петри с агаром, содержащим 5% дефибринированной или цитратной крови. Посевы инкубируют в CO₂ инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в течение 18-24 час. На следующий день просматривают чашки, отбирают подозрительные колонии для последующей идентификации. Если отобранные колонии чувствительны к оптохину, лизируются желчью, не обладают каталазной активностью и в мазках, окрашенных по Граму, представляют грамположительные диплококки и короткие цепочки, тони могут быть идентифицированы как Streptococcus pneumoniae. Для определения К-антигена используют суточную культуру пневмококка, выращенную на агаре, содержащем 10%сыворотки крупного рогатого скота или лошадиной. На чистое обезжиренное стекло наносят по капле 4 поливалентные (пуловые) сыворотки и одну каплю 0,9% раствора натрия хлорида для контроля культуры. Затем в каждую каплю бактериологической петлей или стерильной стеклянной палочкой вносят небольшое количество исследуемой культуры и тщательно растирают. При получении положительного результата (наличие хлопьев или зерен) только в первой капле (выраженная реакция агглютинации с I пуловой сывороткой), в пятой капле с 0,9% раствором NaCl - гомогенная муть, исследуемый штамм имеет К-антиген 23F.

Пример 2.

Ход исследования аналогичен примеру 1. Если положительный результат получен в первой и во второй капле (с 1 и 2 пуловыми сыворотками), а в капле 0,9% раствора NaCl - гомогенная муть, то исследуемый штамм имеет К-антиген 19F.

Пример 3.

Ход исследования здесь и во всех примерах идентичен. Если положительная реакция агглютинации наблюдается в первой и третьей капле (с 1 и 3 пуловыми сыворотками), а в капле 0,9% раствора NaCl - гомогенная муть, то исследуемый штамм имеет К-антиген 6A.

Пример 4.

При получении положительного результата с 1 и 4 пуловыми сыворотками (в первой и четвертой каплях) и гомогенной мути в пятой капле (с 0,9% NaCl) определен К-антиген 7F.

Пример 5.

При получении положительной реакции агглютинации только со 2 пуловой сывороткой (во второй капле) и наличии гомогенной мути в капле 0,9% раствора NaCl определяется К-антиген 18С.

Пример 6.

Положительный результат со 2 и 3 пуловыми сыворотками (во второй и третьей капле) и гомогенная муть в пятой капле (с 0,9% раствором NaCl) означает, что исследуемый штамм имеет К-антиген 9V.

Пример 7.

Положительный результат со 2 и 4 пулевыми сыворотками (во второй и четвертой капле) и гомогенная муть в капле 0,9% раствором NaCl указывает на наличие К-антигена 6В.

Пример 8.

Положительный результат только в третьей капле (с 3 пуловой сывороткой) и гомогенная муть в капле 0,9% раствора NaCl означает, что типируемый штамм имеет К-антиген 19А.

Пример 9.

Если выраженная реакция агглютинации получена с 3 и 4 пулевыми сыворотками (в третьей и четвертой каплях), а в капле 0,9% раствора NaCl - гомогенная муть, то типируемый штамм имеет К-антиген 1.

Пример 10.

При получении положительного результата только с 4 пуловой сывороткой (в четвертой капле) и гомогенной мути с 0,9% раствором NaCl (в пятой капле) определяется К-антиген 3.

Пример 11.

При получении положительного результата с 1, 2 и 3 пуловыми сыворотками (в первой, второй и третьей каплях) и гомогенной мути с 0,9% раствором NaCl (в пятой капле) определяется К-антиген 4.

Пример 12.

При получении положительного результата со 2, 3 и 4 пуловыми сыворотками (во второй, третьей и четвертой каплях) и гомогенной мути с 0,9% раствором NaCl (в пятой капле) определяется К-антиген 5.

Пример 13.

При получении положительного результата со всеми пуловыми сыворотками (в первой, второй, третьей и четвертой каплях) и гомогенной мути в капле 0,9% раствора NaCl (в пятой капле) определяется К-антиген 14.

В капле 0,9% раствора NaCl всегда должна быть гомогенная муть, наличие в этой капле хлопьев или зерен свидетельствует о том, что исследуемый штамм находится в R-форме. В этом случае реакция агглютинации наблюдается во всех каплях. Определить К-антиген у такого штамма не представляется возможным.

Таким образом, при использовании заявленного способа сокращаются трудозатраты, снижается трудоемкость. Способ прост в исполнении. Оценка объективных результатов осуществляется в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе.