Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ОТ ДРУГИХ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ РОДА BACILLUS НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧИЙ В СТРУКТУРЕ ХРОМОСОМНЫХ ГЕНОВ

Изобретение относится к области молекулярной микробиологии, в частности к диагностике возбудителя сибирской язвы. Предложенное изобретение позволяет быстро и эффективно выявлять ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды при проведении диагностических исследований в практическом здравоохранении и ветеринарии и осуществлять надежную дифференциацию от других бациллярных видов.

Возбудитель сибирской язвы - грамположительный спорообразующий микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus. В наиболее близком филогенетическом родстве с В. anthracis состоят виды В. cereus, В. thuringiensis, В. mycoides, В. pseudomycoides и В. weihenstephanensis. Схожесть генетических, морфологических и физиологических характеристик позволяет выделить их в особую таксономическую группу, так называемую «1-ю группу бацилл».

Классическая схема исследования материала на наличие возбудителя сибирской язвы основана на определении фенотипических признаков - морфологии колоний, чувствительности к пенициллину в тесте "жемчужного ожерелья", чувствительности к диагностическим бактериофагам, способности к образованию L-глютаминовой капсулы на специальных средах, отсутствию гемолиза на агаре с дефибринированной кровью барана, отсутствию подвижности и активности щелочной фосфатазы. Тем не менее, довольно часто выделяют штаммы В. anthracis, которые по одному или нескольким признакам отличаются от типичной характеристики.

Известен способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro, осуществляемый на специальных питательных средах для тестирования образования капсулы и сибиреязвенного токсина в атмосфере СО₂ [1]. Известен способ идентификации В. anthracis с дифференциацией штаммов по продукции капсулы, про-тективного антигена и антигенов S-слоя, заключающийся в высеве культуры штамма на специальную среду для тестирования образования капсулы в атмосфере СО₂ и последующей постановке реакции иммунодиффузии с использованием сывороток к протективному антигену и белкам S-слоя сибиреязвенного микроба [2]. Однако данные способы разработаны для работы с чистой культурой В. anthracis, с их помощью нельзя проводить детекцию возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды и дифференциацию от других представителей рода Bacillus.

Современное развитие генетики и молекулярной микробиологии позволяет осуществлять диагностику патогенных бактерий на основе амплификационных и секвенационных технологий. Молекулярно-генетическая дифференциация обладает высокой разрешающей способностью и исключает различные интерпретации, связанные с фенотипической изменчивостью бактерий. В геноме возбудителя сибирской язвы, помимо хромосомы, присутствуют две плазмиды - pXO1 и pXO2. Плазмидные гены детерминируют синтез основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба. Наличие плазмид pXO1 и pXO2 является дифференциально-диагностическим признаком, отличающим В. anthracis от других представителей рода Bacillus. Практически все отечественные и зарубежные ПЦР-системы индикации возбудителя сибирской язвы основаны на выявлении последовательностей плазмидных генов.

Известен способ выявления возбудителя сибирской язвы с использованием коммерческого набора ГенСиб - «Тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХО1+методом полимеразной цепной реакции» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г.Саратов) [3]. Набор содержит праймеры, комплементарные к фрагменту последовательностей гена pagA, расположенного на плазмиде pXOl. Однако данная тест-система не детектирует моноплазмидные штаммы В. anthracis, содержащие только плазмиду pXO2, или бесплазмидные производные. Кроме того, с ее помощью нельзя отличить вакцинные штаммы В. anthracis от вирулентных.

Известен способ выявления возбудителя сибирской язвы с использованием коммерческого набора «АмплиСенс^® В. anthracis - FRT: набор реагентов для выявления ДНК вегетативных форм и спор Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, г.Москва) [4]. Тест-система основана на выявлении фрагмента pagA гена, локализованного в составе плазмиды pXO1, и сарА гена, расположенного на плазмиде pXO2. Однако она не определяет штаммы сибиреязвенного микроба, лишенные плазмид. Бактериальные плазмиды менее стабильные генетические элементы, чем хромосомная ДНК, и могут с разной частотой элиминироваться. С другой стороны, плазмиды, идентичные pXO1 и pXO2, обнаруживаются у отдельных штаммов близкородственных В. anthracis бациллярных видов [5, 6, 7]. Некоторые из таких необычных штаммов изолированы от людей или животных с симптомами заболевания, напоминающего сибирскую язву.

Большей специфичностью обладают тест-системы, содержащие праймеры на фрагменты хромосомных генов. Однако поиск видоспецифичных хромосомных локусов затруднен ввиду высокой гомологии хромосомных ДНК возбудителя сибирской язвы и отдельных представителей вида B. cereus [8].

Известны способы детекции В. anthracis и внутривидовой дифференциации по плазмидному составу, основанные на комплексном использовании праймеров на фрагменты генов pag, суа, lef, локализованных на плазмиде pXO1, гена cap, расположенного на плазмиде pXO2, и хромосомной последовательности Ва813 [9, 10]. Однако уникальность маркера Ва813 для возбудителя сибирской язвы поставлена под сомнение после обнаружения отдельных штаммов В. cereus и В. thuringiensis, содержащих последовательность Ва813, идентичную с возбудителем сибирской язвы [11].

Известен способ идентификации и дифференциации В. anthracis с использованием мультиплексной амплификационной тест-системы, включающей праймеры на фрагменты плазмидных генов суа и сарС, а также хромосомного гена sap, кодирующего белок S-слоя [12]. Однако по данным полногеномных сиквенсов, представленных в базах данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), нуклеотидные последовательности гена sap у штаммов В. anthracis и отдельных представителей других видов рода Bacillus идентичны.

Qi Y. et al., сравнивая хромосомные последовательности бациллярных штаммов, обнаружили у сибиреязвенного микроба синонимичную замену одного нуклеотида в гене rpoB, кодирующего β-субъединицу РНК полимеразы [13]. Показана перспективность использования данного маркера для осуществления дифференциации В. anthracis среди филогенетически близких видов рода Bacillus. Однако в последующем при тестировании 319 бациллярных штаммов был выявлен штамм В. cereus с последовательностью гена rpoB, идентичной аналогичной последовательности у В. anthracis [14].

Agaisse Н. et al. в процессе сравнительного анализа секвенированных геномов В. anthracis и В. cereus выявили полиморфизм единичного нуклеотида в хромосомном гене плейотропного регулятора plcR [15]. Транскрипционный регулятор plcR ответственен за различные функции клетки, имеющие отношение к патогенности микроорганизма и выживанию в агрессивной внешней среде. Нонсенс мутация в гене plcR используется при типировании штаммов В. anthracis различного происхождения и относится к каноническим SNP (single nucleotide polymorphism) [16]. Hurtle W. et al. выявили единичную синонимичную нуклеотидную замену в хромосомном гене gyrA штаммов В. anthracis, позволяющую отличать их от представителей других бациллярных видов [17]. На основе полиморфизма гена gyrA был создан зонд с флуоресцентной меткой. Однако для выявления генетических изменений в виде единичных нуклеотидных замен необходимо специальное оборудование для проведения ПЦР в реальном времени или секвенирования. Кроме того, мутации в виде единичных нуклеотидных замен подвержены обратной реверсии.

Irenge L. et al. была предложена двухэтапная ПЦР в реальном времени для диагностики сибиреязвенной инфекции [18]. На первом этапе проводится скрининг штаммов В. anthracis с помощью плазмидных генов сибиреязвенного микроба, на втором этапе проводится более специфичное выявление штаммов В. anthracis с применением хромосомных мишеней на гены pur А и ptsI. Однако диагностическое исследование, осуществляемое в два этапа, более продолжительно по времени и менее экономично.

Wielinga P. et al. разработали мультилокусную ПЦР в реальном времени для одновременного выявления хромосомного и плазмидных локусов возбудителя сибирской язвы. В качестве хромосомного маркера выбран лямбда-профаг 3 типа, входящий в состав консервативного региона ДНК В. anthracis [19]. Однако не исключена вероятность рекомбинационных событий в геноме В. anthracis, приводящих к элиминации профага.

В 2011 году Ahmod N. et al. нашли делецию 72 п.н. в консервативной области хромосомы возбудителя сибирской язвы, в кодирующем АТФ-синтазу гене уеаС [20]. Тестирование со специфичными праймерами 174 бациллярных штаммов, в том числе 39 штаммов возбудителя сибирской язвы, показало наличие мутации в подавляющем большинстве штаммов В. anthracis, за исключением В. anthracis А1055. Хромосомный маркер уеаС был рекомендован для дифференциации сибиреязвенного микроба от штаммов других бациллярных видов методом ПЦР и пиросеквенирования. Однако использование хромосомной мутации в виде делеции части нуклеотидов в каком-либо гене не позволяет эффективно детектировать микроорганизм. Для одновременной индикации бактериального патогена и его дифференциации от близкородственных видов оптимально использование нескольких видоспецифичных локусов.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего детектировать возбудитель сибирской язвы при проведении диагностических исследований и проводить дифференциацию от других представителей рода Bacillus.

Технический результат заключается в эффективной индикации сибиреязвенного микроба и повышении надежности его дифференциации от штаммов филогенетически близких видов.

Технический результат достигается индикацией возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции с праймерами на хромосомные гены, который предусматривает пробоподготовку, выделение ДНК, постановку ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных последовательностям хромосомных генов fliC и hom2.

Праймеры на эти гены имеют следующие последовательности:

fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3',

fliC-R: 5*-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3',

hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3',

hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3*.

Результаты оценивают по наличию амплифицированных фрагментов генов и по их размерам. Образование продукта амплификации с праймерами на фрагмент гена fliC размером 153 п.н. свидетельствует о принадлежности штамма к виду В. anthracis. Присутствие продукта амплификации с праймерами на фрагмент гена hom2 размером 550 п.н., напротив, исключает отнесение изолята к возбудителю сибирской язвы.

Заявляемый способ основан на использовании в качестве ДНК-мишеней фрагментов хромосомных генов fliC и hom2. Ранее в процессе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов жизнеобеспечения бациллярных штаммов нами были выявлены специфичные для возбудителя сибирской язвы хромосомные мутации. Один из высокоспецифичных участков был найден в гене fliC, детерминирующем синтез флагеллина - главного компонента бактериального жгутика. В позиции 383 п.н. от начала гена fliC у штаммов В. anthracis присутствует вставка 231 нуклеотида, приводящая к прекращению синтеза флагеллина. При постановке ПЦР с праймерами, комплементарными фрагменту последовательностей вставки, образование продукта амплификации происходит при взаимодействии с ДНК В. anthracis.

Дополнительной ДНК-мишенью при проведении диагностических исследований служит обнаруженная нами мутация в гене hom2, кодирующем фермент гомосериндегидрогиназу. Делеция 42 нуклеотидов в позициях с 1042 п.н. по 1083 п.н. от начала гена hom2 блокирует синтез L-гомосерина, из которого в результате ряда последовательных реакций образуются метионин, треонин и цистеин. Ввиду относительно небольшой протяженности дефекта ДНК праймеры на ген hom2 подобраны таким образом, чтобы последовательность одного из них приходилась непосредственно на область делеции. В этом случае образование продукта амплификации регистрируется только в реакциях с ДНК штаммов бациллярных видов, отличных от В. anthracis. Использование дополнительного хромосомного локуса повышает надежность дифференциации возбудителя сибирской язвы от штаммов филогенетически близких видов. Мутация в гене hom2, по-видимому, возникла на начальном этапе ответвления от общего предшественника и формирования В. anthracis в качестве самостоятельного вида. В этом случае она является видоспецифичным генетическим маркером.

Возможности заявляемого способа предусматривают введение плазмидных маркеров, что позволяет одновременно с детекцией сибиреязвенного микроба определять принадлежности изолята к вирулентным, вакцинным или атипичным штаммам. Расчет праймеров и подбор условий полимеразной цепной реакции проведены с учетом перспективы использования в одной реакционной смеси праймеров на фрагменты хромосомных генов fliC, hom2 и плазмидных детерминант pagA, cap А [19]. Размер образующихся в мультилокусной ПЦР продуктов амплификации позволяет отличать их друг от друга при электрофоретическом разделении в агарозном геле. Постановка одноэтапной ПЦР экономически целесообразнее и требует меньше времени на проведение исследования.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение ДНК из материала предварительно обеззараженного по стандартной методике проводят в соответствии с МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1- IV групп патогенности» (М., 2009).

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3. 2569-09) с применением вышеуказанных праймеров на гены hom2 и fliC.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов генов hom2 и fliC, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у бациллярных штаммов, представленных в базах данных NCBI: В. anthracis Ames, Ames 0581, Steme, CDC 684, A0248; В. cereus ATCC14579, ATCC10987, ZK, AH187, B4264, AH820, G9842, Q1, 03BB102; Bacillus thuringiensis 97-27, Al Hakam, BMB171; B. weihenstephanensis KBAB4_4052, B. licheniformis ATCC 14580, DSM13; B. megaterium QM B1551, DSM 319; B. subtilis subsp.spizizenii, BSU35150, BSn5. Праймеры проанализированы с помощью компьютерной программы BLAST на web-сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для подтверждения их специфичности и отсутствия гомологии с нуклеотидными последовательностями штаммов бациллярных видов, присутствующих в базах данных (GenBank, EMBL, DDBJ).

С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов hom2 и JliC, определяют наличие и размеры полученных ампликонов. Праймеры на гены hom2 и fliC имеют следующие последовательности:

fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3',

fliC-R: 5'-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3',

hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3',

hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3'.

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов hom2 и fliC осуществляют по следующей программе: один цикл 94°С в течение 5 мин, 30 циклов при 94°С - 30 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 30 сек и завершающий цикл - 3 мин при 72°C. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводят методом электрофореза в 2% агарозном геле относительно стандарта маркеров молекулярных масс с размером от 100 до 3000 п.н.

Для штаммов сибиреязвенного микроба продукт ПЦР соответствует размеру 153 п.н., для штаммов других бациллярных видов - 550 п.н.

Таким образом, разработанный способ позволяет в короткий срок детектировать возбудитель сибирской язвы, а также проводить его достоверную дифференциацию от других представителей рода Bacillus.

Сущность изобретения поясняется примером.

Пример. Исследование материала, содержащего культуру штамма В. anthracis или штамма другого бациллярного вида (Модельный эксперимент).

Обеззараживание исследуемых проб проводят согласно Методическим указаниям МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР».

Выделение ДНК осуществляют с помощью «Набора реагентов для подготовки проб (выделения ДНК)» выпускаемого ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Реакционную смесь для постановки реакции ПЦР приготовляют по прописи:

вода деионизированная - 12,5 мкл,

раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мкл,

праймер fliC-F (12 пМ/ мкл) - 0,5 мкл,

праймер fliC-R (12 пМ/ мкл) - 0,5 мкл,

праймер hom2-F (12 пМ/ мкл) - 0,5 мкл,

праймер hom2-R (12 пМ/ мкл) - 0,5 мкл,

реакционный буфер НПФ (×10) - 2,5 мкл,

MgCl₂ 0,25 М - 0,8 мкл,

фермент Taq-полимераза (5 ед./ мкл) - 0,2 мкл,

исследуемая проба ДНК - 5 мкл.

Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.

Амплификацию фрагментов генов fliC и hom2 в ПЦР проводят по схеме: денатурация - 94°С в течение 5 мин, 30 циклов при 94°С - 30 сек, отжиг праймеров - 58°С - 30 сек, элонгация цепи 72°С - 30 сек и завершающий цикл - 3 мин при 72°С. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов осуществляют в 2% агарозном геле.

Во всех пробах, содержащих ДНК В. anthracis, синтезируется продукт амплификации размером 153 п.н., определяющий вставку в гене fliC. При тестировании ДНК представителей различных бациллярных видов регистрируют продукт амплификации размером 550 п.н., выявляющий неизмененные последовательности гена hom2. Ввиду делеции части нуклеотидных последовательностей гена hom2 у штаммов возбудителя сибирской язвы амплификация с рассчитанными праймерами на его фрагмент в этих пробах не происходит (чертеж). На чертеже представлены результаты ПЦР-анализа с праймерами на фрагменты генов fliC и hom2 штаммов В. anthracis и других бациллярных видов: 1. В. anthracis Pasteur; 2. В. anthracis 55; 3. В. anthracis Ихтиман; 4. В. anthracis КМ86 (7); 5. В. anthracis КМ86 (8); 6. В. anthracis Sterne 34F2; 7. В. anthracis СТИ-1; 8. В. anthracis КМ35; 9. В. anthracis 29; 10. В. anthracis KM 91; 11. маркер молекулярных масс «О' GeneRuler™ 100bp DNA Ladder Plus redy-to-use» (Fermentas) (3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500,400, 300, 200, 100 п.н.); 12. В. thuringiensis HD-1; 13. B. thuringiensis 2090; 14. B. thuringiensis 69/6; 15. B. cereus 569; 16. B. cereus 108; 17. B. cereus 8; 18. B. pseudoanthracis 104.

Чувствительность реакции амплификации с праймерами fliC-F, fliC-R, hom2-F и hom2-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистой культуры возбудителя сибирской язвы В. anthracis, и составила 1×10²-1×10⁴ спор/мл.

Литература

1. Еременко Е.И., Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н. Способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro // Патент РФ №2101351 (C12N 1/20, C12Q 1/04, C12N 1/20, C12R 1:07) - опубликовано 10.01.1998 г.

2. Баркова И.А., Барков A.M., Алексеев В.В., Липницкий А.В. Способ идентификации Bacillus anthracis с дифференциацией штаммов по продукции капсулы, протективного антигена и антигенов S-слоя // Патент РФ №2376385 (C12Q 1/04, C12R 1/07, G01N 33/559) - опубликовано 20.12.2009 г.

3. Тучков И.В. Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы // Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Саратов, 2005. - 19 с.

4. Абдрашитова А.С., Саяпина Л.В., Малахаева А.Н., Осина Н.А. Изучение эффективности наборов реагентов для детекции ДНК возбудитеклей сибирской язвы, Бруцеллеза и холеры методом ПЦР в режиме «реального времени» // Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера (Материалы XI Международной научно-практической конференции). Саратов. - 2012. - С.13-15.

5. Avashia S., Riggins W., Lindley С, Hoffmaster A., Drumgoole R., Nekomoto,T., Jackson P., Hill K., Williams K., Lehman L., Libal M., Wilkins P., Alexander J., Tvaryanas A., Betz T. Fatal pneumonia among metalworkers due to inhalation exposure to Bacillus cereus containing Bacillus anthracis toxin genes // Clin. Infect. Dis. - 2007. - V.44. - P.414-416.

6. Hoffmaster A., Ravel J., Rasko D., Chapman G., Chute M., Marston C, De В., Sacchi C, Fitzgerald C, Mayer L., Maiden M., Priest F., Barker M., Jiang L., Cer R., Rilstone J., Peterson S., Weyant R., Galloway D., Read Т., Popovic Т., Fraser C. Identification of anthraxtoxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2004. - V.101. - P.8449-8454.

7. Klee S., Ozel M., Appel В., Boesch C, Ellerbrok, H., Jacob D., Holland G., Leendertz F., Pauli G., Grunow R., Nattermann H. Characterization of Bacillus anthracis-\\k& bacteria isolated from wild great apes from Cote dTvoire and Cameroon // J. Bacteriol. - 2006. -V.188.-P.5333-5344.

8. Tourasse N., Helgason E., Okstad O., Hegna I., Kolsto A. The Bacillus cereus group: novel aspects of population structure and genome dynamics // J. Appl. Microbiol. - 2006. -V.101.-P.579-593.

9. Patra G., Sylvestre P., Ramisse V., Therasse J., Guesdon J. Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - V.15. - P.223-231.

10. Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bacillus anthracis bymultiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXOl and pXО2 and chromosomal DNA // FEMS Microbiol. Letters. - 1996. - V.145. - P.9-16.

11. Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C, Mock M. Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997 // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V.36. - P.3412-3414.

12. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis II Журн. микробиол. - 2005. - №3. - С.69-74.

13. Qi Y., Patra G., Liang X., Williams L., Rose S., Redkar R., DelVecchio V. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis II Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - V.67(8). - P.3720-3727.

14. Zasada A., Gierczynski R., Raddadi N., Daffonchio D., Jagielski M. Some Bacillus thuringiensis strains share rpoB nucleotide polymorphisms also present in Bacillus anthracis II J. Clin. Microbiol. - 2006. - V.44. - P.1606-1607.

15. Agaisse H., Gominet M., Okstad O., Kolstø A., Lereclus D. PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis // Mol Microbiol. - 1999. - V.32. - P.1043-1053.

16. Easterday R., Van Ert M., Simonson Т., Wagner D., Kenefic L., Allender C, Keim P. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis II J. Clin. Microbiol. - 2005. - V.43 (4). - P.1995-1997.

17. Hurtle W., Bode E., Kulesh D., Kaplan R., Garrison J., Bridge D., House M., Frye M., Loveless В., Norwood D. Detection of the Bacillus anthracis gyrA gene by using a minor groove binder probe. J. Clin. Microbiol. - 2004. - V.42. - P.179-185.

18. Irenge L., Durant J., Tomaso H., Pilo P. Olsen J., Ramisse V., Mahillon J., Gala J. Development and validation of a real-time quantitative PCR assay for rapid identification of Bacillus anthracis in environmental samples //Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V.88.-P.1179-1192.

19. Wielinga P., Hamidjaja R., Agren J., Knutsson R., Segerman В., Flicker M., Ehling-Schulz M., Groot A., Burton J., Brooks Т., Janse I., Rotterdam B. A multiplex real-time PCR for identifying and differentiating B. anthracis virulent types // International J. Food Microbiol. - 2011. - V. 145. - P. 137-144.

20. Ahmod N., Gupta R., Shah H. Identification of a Bacillus anthracis specific indel in the yeaC gene and development of a rapid pyrosequencing assay for distinguishing B. anthracis from the B. cereus group // J. Microbiol. Methods. - 2011. - V. 87. - P. 278- 285.