ЭНТЕРОСОРБЕНТ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ СОРБЦИИ ХОЛЕРНОГО ЭКЗОТОКСИНА, ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ЭНТЕРОСОРБЕНТА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ СОРБЦИИ ХОЛЕРНОГО ЭКЗОТОКСИНА

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению медицинского энтеросорбента, обладающего избирательной сорбцией холерного токсина, и может быть наиболее эффективно использовано в экстренной терапии и профилактике холеры.

Проблема холеры в мире не теряет своей остроты на ближайшую перспективу и чрезвычайно важными остаются вопросы своевременной эффективной профилактики и лечения указанного конвенционного заболевания.

Известно, что одним из основных средств лечения холеры являются полиионные растворы для внутривенной и оральной регидратации: Квартасоль, Хлосоль, Глюкосолан, Цитроглюкосолан и др. Однако при всей доступности парентеральной и оральной регидратации в группу риска при тяжелых формах холеры входят маленькие дети (до 2-х лет), пожилые люди, а также пациенты с осложненным преморбидным фоном, наиболее уязвимые в отношении сильного обезвоживания организма, особенно в начале крупных эпидемических вспышек. Это обусловлено проблемами в организации неотложного лечения, отсутствием достаточного количества регидратационных растворов, недостатком эффективных антибактериальных средств, отсутствием эффективных средств экстренной профилактики.

Этиотропная терапия повышает эффективность регидратационных мероприятий при холере: уменьшает длительность и объемы диареи, сокращает сроки вибриононосительства [1]. Однако применение антибиотиков и химиопрепаратов ограничивается наличием противопоказаний, влечет за собой рост антибиотикорезистентности, утяжеление клинического течения болезни; широкое и бесконтрольное использование этиотропных средств сопровождается нежелательными побочными эффектами и может иметь неблагоприятные последствия для организма больного [2].

Известно использование иммунобиологического препарата для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных патогенными и условно-патогенными грамотрицательными микроорганизмами кишечной группы и экзотоксинами [3]. Препарат содержит иммуноглобулиновый препарат, полученный иммунизацией животных вакциной, содержащей шигеллезные корпускулярные антигены и анатоксин, и один компонент, выбранный из ряда: лактоферрин, ферменты, ингибиторы протеолитических ферментов, препараты нормофлоры человека и/или животных, дрожжи, витамины, витаминоподобные вещества, белки острой фазы человека и/или животных, цитокины человека и/или животных, компоненты высших растений, компоненты низших растений, компоненты продуктов природного происхождения, продукты пчеловодства, энтеросорбенты, антибиотики, противомикробные химиопрепараты, сульфаниламидные препараты, противомикробные и противопаразитарные препараты природного происхождения, противотуберкулезные препараты, противовирусные препараты, противогрибковые антибиотики, синтетические противогрибковые препараты и т.д., при этом энтеросорбенты выбраны из ряда: препараты угля активированного, энтеросорбент СКН, карболонг, полифепан, цеолиты, гуммивит, каолин, кизельгур, монтмориллонит.

Несмотря на широкий спектр действия данного иммунобиологического препарата в отношении различных патогенных и условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов кишечной группы и их экзотоксинов, иммуноглобулины, входящие в состав иммунобиологического препарата, не обладают направленной специфичностью к холерному токсину; кроме того, препарат недостаточно эффективен с позиции энтеросорбционного агента. Предполагаем, что это объясняется низким содержанием энтеросорбента - 0,05-0,7 г до массы таблетки 0,55 г или 0,1 г до массы суппозитория 1,4 г.

Известно использование энтеросорбентов для лечения и профилактики ряда инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Лечебный эффект энтеросорбентов проявляется в результате их прямого и опосредованного действия на патогенетические механизмы [4, 5].

Энтеросорбенты способны поглощать эндо- и экзотоксины, фиксировать и элиминировать возбудителей бактериальной и вирусной природы. Высокая антибактериальная активность энтеросорбентов не только способствует санации ЖКТ от патогенов, но и оказывает опосредованное иммуномодулирующее действие за счет детоксикации и предупреждения антигенной перегрузки иммунной системы, что создает благоприятные условия для купирования инфекционного процесса [6, 7].

В качестве средства этиотропной терапии кишечных инфекций используются кремнийсодержащие энтеросорбенты (Полисорб, Каолин, Смекта, и др.), а также препараты на основе природных и синтетических смол, синтетических полимеров и неперевариваемых липидов (Холестирамин, Холезивилам и др.).

Известна большая группа углеродных энтеросорбционных средств, оказывающая положительный эффект при лечении острых кишечных инфекций на основе активированных углей (уголь активированный, карболен, карбоктин, гастросорб, Карбодон); гранулированных углей (марки СКН, СКТ-6А, СУГС, СКАН и др.); углеволокнистых материалов (ваулен, актилен, карболайн).

Известны энтеросорбционные средства на основе пищевых волокон, лигнина гидролизного, хитина, пектинов и альгинатов (микрокристаллическая целлюлоза - МКЦ, Полифепан, Мультисорб, Экстралакт, Альгисорб, Зостерин, Микотон, Фильтрум-СТИ), успешно применяемые для профилактики и лечения острых и хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Известно средство, обладающее энтеросорбционной, иммуномодулирующей, антитоксической и противовоспалительной активностью, состоящее из винных дрожжей, пшеничных отрубей и минералов. Известное средство получают путем культивирования микроорганизма на съедобном растительном (зерновом или соевом сырье) или молочном сырье, в качестве микроорганизма используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae (vini) ВКМП Y-511, культивирование ведут при температуре 20-40°C, после культивирования полученную культуру инактивируют и подвергают высушиванию [8].

Одним из принципиальных недостатков большинства энтеросорбентов является их неселективность - отсутствие специфического механизма направленного устранения причин экзо- и эндотоксикозов, что существенно снижает результативность лечения и профилактики, в особенности при специфическом лечении холеры.

Как следует из проведенного анализа, в настоящее время отсутствуют специфические энтеросорбционные препараты, направленные на эффективную нейтрализацию экзотоксина холерного вибриона.

В целях получения селективных энтеросорбентов в основном используется адсорбционная иммобилизация с удерживанием адсорбированных молекул на поверхности носителя за счет неспецифических вандерваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами активного вещества. Преимуществами адсорбционной иммобилизации являются: отсутствие сложных технологических схем, доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в качестве носителей. Не разрушая структуру матрицы и тем самым обеспечивая сохранность сорбционных свойств исходного сорбционного материала, адсорбционная иммобилизация позволяет получить эффективные специфические энтеросорбционные препараты.

Задачей изобретения является получение энтеросорбента, обладающего специфичностью в отношении холерного экзотоксина и получение твердой лекарственной формы энтеросорбента для направленной сорбции холерного экзотоксина.

Достигаемый технический результат соответствует поставленным задачам и заключается в получении лекарственного средства для направленной сорбции холерного экзотоксина, обеспечивающего снижение либо полную нейтрализацию действия холерного экзотоксина.

Поставленная задача решается энтеросорбентом для направленной сорбции холерного экзотоксина, полученным путем иммобилизации методом адсорбции антитоксического противохолерного иммуноглобулина G, выделенного из сыворотки крови животных, иммунизированных холерным токсином, на микрочастицах размером 200-300 нм предварительно подготовленного кислоторастворимого хитозана при соотношении иммуноглобулина G и хитозана 0,08-0,1:1 соответственно.

Иммуноглобулины (Ig) класса G, основные антитоксические детерминанты, наиболее активны при вторичном иммунном ответе и антитоксическом иммунитете. Антитоксические противохолерные IgG получают из иммунной сыворотки крови животных по стандартной методике высаливания насыщенным раствором сульфата аммония с последующей гель-фильтрацией.

Выбор хитозана с молекулярной массой 200 кДa и степенью дезацетилирования 85% в качестве энтеросорбционной основы, по результатам собственных исследований, обусловлен его высокой сорбционной емкостью по отношению к специфическому компоненту и обратимой сорбцией белковых молекул (антитоксическим иммуноглобулинам). Хитозан также проявляет иммуномодулирующие, антианемические и цитопротекторные свойства; нетоксичен, механически прочен, нетравматичен для слизистых оболочек рта, пищевода, желудка. Хитозан способен связывать разнообразные низко- и высокомолекулярные соединения, вплоть до бактериальных клеток, проявляя при этом некоторую селективность [9, 10]. Из литературных данных известно использование хитозана в качестве исходного материала для микрокапсулирования при создании пролонгированной формы сильнодействующего неспецифического биологического агента, в качестве сорбционной матрицы для доставки лекарственного средства, а также как самостоятельное средство для лечения инфекционных заболеваний (например, дизентерии Флекснера) [11, 12, 13].

Задача также решается тем, что получена лекарственная форма энтеросорбента в виде таблетки или гранулята, расфасованного в капсулы, включающая активный компонент - энтеросорбент и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из групп: разбавители, разрыхлители, связующие вещества, вещества, способствующие скольжению при прессовании.

Разбавители используют для обеспечения необходимой массы таблетки. Разбавители в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются следующими веществами: глюкоза (декстроза), крахмал, кальция гидрофосфат, кальция карбонат, лактозы моногидрат, магния карбонат, сорбит (сорбитол), микрокристаллическая целлюлоза, маннит (маннитол).

Разрыхлители (дезинтегранты), включающие в состав твердой лекарственной формы с целью обеспечения их распадаемости, в настоящем изобретении содержат, но не ограничиваются следующими веществами: поперечносшитый повидон, альгиновая кислота и ее натриевая и калиевая соли, крахмал (в том числе химически модифицированный), метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза (кармеллоза натрия), кроскармеллоза, кросповидон, мальтоза, микрокристаллическая целлюлоза.

Связующие вещества вводят для обеспечения прочности гранул и таблеток. С этой целью используют крахмальный клейстер, желатин, сахарозу, натрия альгинат, гели альгиновой кислоты, природные камеди, макрогол, производные целлюлозы, повидон (поливинилпиролидон), повидон-винилацетат (коповидон).

Вещества, способствующие скольжению, препятствуют прилипанию к пресс-инструменту, оказывают смазывающее действие, улучшают текучесть таблетируемых смесей, замедляют скорость распадаемости таблетки и растворения действующего вещества. К ним относятся крахмал, тальк, аэросил (кремния диоксид коллоидный), каолин, обезжиренный молочный порошок (лактоза), макрогол, полисорбат, стеариновая кислота и ее кальциевая и магниевая соли, полисорбат-80, натрия лаурилсульфат.

Лекарственная форма энтеросорбента получена путем смешивания лиофильно высушенного активного компонента - энтеросорбента, по меньшей мере, с одним вспомогательным веществом, пригодным для приготовления энтеросорбента в твердой лекарственной форме из группы разбавителей, разрыхлителей и веществ, способствующих скольжению. Полученную смесь гранулируют, по меньшей мере, с одним из группы связующих веществ, затем гранулы таблетируют и покрывают кишечнорастворимой оболочкой либо полученные гранулы помещают в кишечнорастворимые капсулы.

Сущность изобретения поясняется на примерах.

Пример 1. Способ получения активного компонента - энтеросорбента для направленной сорбции холерного экзотоксина.

Получение антитоксической противохолерной сыворотки - основы специфического компонента антитоксических иммуноглобулинов осуществляют путем гипериммунизации животных-продуцентов. В данном примере в качестве животных-продуцентов используют кроликов породы «Шиншилла», но не ограничиваются данной биомоделью. В качестве антигена используют холерный токсин, выделенный из культуральной жидкости штамма Vibrio cholerae cholerae О1 569 В (серовар Инаба) по общепринятой методике Mekalanos J.J. et al. [14]. Схема иммунизации состоит из 8 подкожных инъекций (табл. 1). Первую инъекцию, доза которой составляет 100 мкг/мл, проводят с адъювантом, в качестве которого применяют 0,5% раствор хитозана молекулярной массой 30 кДа (хитозан растворяют в 0,15M растворе натрия хлорида в соотношении 1:1) [15]. В отличие от полного адьюванта Фрейнда (ПАФ), низкомолекулярный хитозан не вызывает необратимых некротических изменений тканей в местах введения, при этом стимулирует антителообразование на уровне ПАФ. Через 7-10 суток после последней инъекции проводят забор крови и последующее отделение сыворотки от фибрина и форменных элементов крови.

Выделение иммуноглобулиновой фракции осуществляют следующим образом. Антитоксическую сыворотку разводят водой очищенной в 2 раза и охлаждают до температуры (6±2)°С. Затем к разведенной сыворотке медленно при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке без подогрева добавляют охлажденный до температуры (6±2)°C раствор насыщенного сернокислого аммония pH (7,2±0,1) до конечной концентрации 45%, время экспозиции составляет 16-18 ч, температура (6±2)°C. Сформировавшийся осадок отделяют на центрифуге с охлаждением при 8000 об/мин в течение 15 мин. Контролируют содержание белка спектрофотометрически при длине волны 260 и 280 нм. Расчет белка ведут по формуле , где x - содержание белка, мг/мл; D₍₂₈₀₎ - оптическая плотность раствора при длине волны 280 нм; D₍₂₆₀₎ - оптическая плотность раствора при длине волны 260 нм.

Для получения высокой концентрации иммуноглобулинов в растворе (до 50 мг/мл) полученную фракцию перед хроматографической очисткой растворяют в малых объемах растворителя (0,9% раствор натрия хлорида).

Для хроматографической очистки осажденной иммуноглобулиновой фракции используют хроматографическую колонку, заполненную сефадексом G-50. Элюцию белка проводят 10% карбонатно-бикарбонатным буфером рН (9,1±0,1) при температуре (6±2)°C. Выход белковой фракции контролируют 5% раствором сульфосалициловой кислоты и реактивом Несслера. После гель-фильтрации во фракции определяют содержание белка спектрофотометрически при длине волны 260 и 280 нм, которое должно составлять (45±5) мг/мл. Стерилизующую фильтрацию проводят через фильтры мембранные типа ФМАЦ с размером пор 0,2 мкм. Уровень специфических антител в выделенных антитоксических иммуноглобулинах должен составлять в реакции диффузной преципитации (РДП) и дот-иммуноанализе (ДИА) не менее 1:16 и 1:500 соответственно.

Известно, что кислоторастворимый хитозан обладает более высокими энтеросорбционными свойствами, чем водорастворимый [9, 10]. Однако применение кислоторастворимого полимера возможно только в его биодоступной форме. Подготовку хитозана к иммобилизации активного компонента осуществляют методом осадительной коацервации, применяя в качестве растворителя 1,5% раствор уксусной кислоты. Для поддержания гидрофильно-гидрофобного баланса коацервационной системы используют поверхностно-активное вещество (ПАВ) Tween-80 в концентрации 1%. Реакционную смесь помещают на магнитную мешалку. При постоянном перемешивании добавляют в качестве осадителя, капельно, 10% раствор натрия сульфата. Полученную взвесь осаждают центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин при температуре (20±1)°C. Супернатант, содержащий микрочастицы хитозана, ресуспендируют и дважды отмывают от примесей кислоты, соли и ПАВ водой очищенной. Полученные микрочастицы хранят в виде 1% водной суспензии при температуре (4±1)°C.

Адсорбционную иммобилизацию специфического компонента - антитоксических иммуноглобулинов на микрочастицах хитозана осуществляют в асептических условиях методом адсорбции в соотношении 0,08-0,1:1 (иммуноглобулин:хитозан). Подобранное соотношение компонентов является оптимальным, так как меньшее количество антитоксического иммуноглобулина может привести к недостаточному покрытию матрицы, что отразится на антитоксических свойствах препарата, а большее количество нецелесообразно из-за потери целевого продукта - антитоксического иммуноглобулина.

В стерильную химическую посуду к 1 г сорбента добавляют раствор иммуноглобулина в количестве 80-100 мг/мл. Полученный объем системы доводят до 5 мл 0,01M раствором фосфатно-солевого буфера pH (7,3±0,1), pH смеси соответствует (5,3±1,0). Реакционную смесь инкубируют при температуре (35±2)°C в течение 6-8 ч при постоянном перемешивании, после чего осадок отделяют центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин. Контроль эффективности иммобилизации проводят путем определения количества остаточного белка в супернатанте спектрофотометрически по формуле (1). Процесс адсорбции считают завершенным при содержании остаточного белка в супернатанте не более 10% от первоначального количества.

Для лиофилизации препарата специфического энтеросорбента в качестве защитной среды используют раствор глицина и сахарозы в конечной концентрации 2,5% и 1% соответственно в 0,15M растворе натрия хлорида. В асептических условиях специфический энтеросорбент соединяют с защитной средой до его конечной концентрации 4%. Полученную смесь разливают в стерильные кюветы, толщина слоя не более 10 мм, замораживают в низкотемпературном холодильнике до температуры минус (45±5)°C и промораживают при данной температуре еще в течение 14-18 ч. Затем препарат подвергают лиофилизации в течение 24 ч до конечной температуры материала 25°C потеря в массе при высушивании составляет не менее 1,5%.

Пример 2. Получение твердой лекарственной формы энтеросорбента для направленной сорбции холерного экзотоксина.

Заявляемый энтеросорбент возможно получить в таблетированной форме или в виде капсулы. Для этого к лиофильно высушенному активному компоненту - энтеросорбенту добавляют вспомогательные вещества в соотношении: активный компонент - энтеросорбент 50 масс. %, вспомогательные вещества для гранулирования - 50 масс. %.

В частном случае реализации изобретения в качестве разбавителей используют целлюлозу микрокристаллическую и лактозы моногидрат. Названные вспомогательные вещества берут по 50 масс. %. Например, если масса лиофилизата энтеросорбента составляет 100 г, то к нему добавляют по 50 г целлюлозы микрокристаллической и лактозы моногидрата. Далее полученную смесь подвергают гранулированию. Гранулирование можно осуществлять: сухой грануляцией; влажной грануляцией (гранулирование продавливанием); структурной грануляцией (гранулирование в условиях псевдоожижения).

В данном примере в качестве способа гранулирования рассмотрено применение гранулирования в псевдоожиженном слое с подачей связующего вещества сверху, в качестве которого используют 10% водного раствора поливинилпирролидона (Plasdone К90). Гранулирование проводят до содержания поливинилпирролидона в полученном грануляте от 0,4 до 0,8 масс. %.

Для изготовления таблеток проводили прессование гранулята на таблеточном прессе MiniTabT. Массу таблеток устанавливают в пределах от 0,240 до 0,260 г. После таблетирования гранулята на таблетки наносят пленочное покрытие. Нанесение покрытия на таблетку осуществляют в коутере GMPC I Mini до увеличения массы таблетки на 8%. В качестве кишечнорастворимого покрытия использовали 20% водный раствор Acryl-EZE.

Для получения готовой лекарственной формы в виде капсул гранулят энтерособента в количестве от 0,240 до 0,260 г помещают в кишечнорастворимые капсулы вместимостью 0,50 мл.

Пример 3. Оценка адсорбционной способности энтеросорбента для направленной сорбции холерного экзотоксина в отношении стандартных фармакологических маркеров.

Оценку проводят в сравнении с известными энтеросорбентами на модельных растворах метиленового синего и бычьего сывороточного альбумина.

Определение адсорбционной способности энтеросорбентов (заявляемого и известных) в отношении метиленового синего и бычьего сывороточного альбумина проводят по методикам, изложенным в ФС 42-3246-95 «Таблетки угля активированного» и ВФС 42-2148-92 «Полисорб» в модификации В.И. Решетникова [16, 17].

Полученные данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что для заявляемого специфического энтеросорбента характерны высокие показатели адсорбционной способности по фармакологическим веществам-маркерам, сопоставимые с данными показателями таких энтеросорбционных препаратов, как Полисорб-МП, Карболайн, активированный уголь и Хитозан.

Установлено, что иммобилизация антитоксического иммуноглобулина G, входящего в состав активного компонента энтеросорбента, приводит к изменению электрохимических свойств активной поверхности хитозана, что выражается в повышении показателя адсорбционной активности заявляемого энтеросорбента в отношении белковых агентов (патогенные микроорганизмы и/или их токсины, различные сорбаты средней молекулярной массы).

Пример 4. Адсорбционное действие энтеросорбента в отношении холерного токсина.

Оценку эффективности действия специфического энтеросорбента проводят в опытах in vitro и in vivo на биомоделях. В динамическом опыте in vitro определяют адсорбционную способность и скорость связывания холерного токсина из его модельного раствора заявляемым энтеросорбентом и сравнивают полученные значения с известными энтеросорбентами. Полученные результаты (табл. 3) свидетельствуют о том, что заявляемый энтеросорбент проявляет высокие адсорбционную способность и скорость извлечения холерного токсина из раствора. Максимальная концентрация холерного токсина в фазе сорбента достигается уже через 3 ч от начала эксперимента и составляет 90 мкг/г, что значительно превышает аналогичные показатели известных энтеросорбентов.

Пример 5. Антитоксическое действие энтеросорбентов в отношении холерного токсина.

Для изучения антитоксической активности in vivo в качестве биомоделей используют беспородных белых мышей массой 18-20 г. Применяют препарат очищенного холерного токсина с концентрацией белка 160 мкг/мл и удельной активностью 8,2⋅10² ЕД₅₀/мл. Определение величины ЕД₅₀ для холерного токсина проводят в тесте отека задней конечности на белых мышах [18]. Расчет величины ЕД₅₀ осуществляли по методу Кербера-Ашмарина [19]. Определение антитоксической активности энтеросорбентов проводят следующим образом: навески сорбентов вносят в пробирки с раствором холерного токсина заданной концентрации, перемешивают и инкубируют при температуре (37±2)°C в течение 1 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирают, из полученных проб делают ряд последовательных разведений шагом 5 и вводят в объеме 50 мкл в подошвенную поверхность одной задней конечности. В противоположную конечность вводят такое же количество 0,9% раствора натрия хлорида (контроль). Через 48 ч проводят эвтаназию животных и ампутируют опытную и контрольную лапы по коленному суставу. Ампутированные конечности взвешивают на электронных весах. Разница в массе более 65 мг свидетельствует о наличии токсина в пробе. По результатам титрования на животных рассчитывают показатели относительной токсичности проб (по сравнению с контролем) по формуле: , где ОТ - относительная токсичность холерного токсина; Со - концентрация токсина (титр) в опытной пробе; Ск - концентрация токсина (титр) в контроле.

Установлено, что, обеспечивая значительное снижение показателя относительной токсичности (ОТ) препарата холерного токсина, введенного экспериментальным животным, заявляемый энтеросорбент обладает более высокой антитоксической активностью и нейтрализует холерный токсин в 1,1-6,2 раза эффективнее энтеросорбентов, представленных в таблице 4. Данные эксперимента, отражающие сравнительные показатели антитоксической активности заявляемого и известных энтеросорбентов, представлены в таблице 4.

Пример 6. Оценка стабильности специфической активности заявляемого энтеросорбента при взаимодействии с протеолитическими ферментами.

Оценку проводят в сравнении с неиммобилизованным антитоксическим иммуноглобулином в условиях обработки препаратов протеолитическими ферментами пепсином и трипсином. Специфическую активность заявляемого энтеросорбента и неиммобилизованного иммуноглобулина определяют в непрямом варианте дот-иммуноанализа, результаты которого представлены в таблице 5. Несмотря на снижение титра специфических антител в 4 раза в заявляемом препарате, хитозан оказывает стабилизирующее действие на структуру иммуноглобулина, что влияет на стабильность антитоксических свойств заявляемого энтеросорбента, в отличие от неиммобилизованных иммуноглобулинов, специфическая активность которых снижается при обработке протеолитическими ферментами в 20 раз.

ЛИТЕРАТУРА

1. Холера [Электронный ресурс] / А.В. Сундуков [и др.] // Лечащий врач. - 2010. - №10. Режим доступа: ЛВ http://www.lvrach.ru/2011/11/15435309.

2. Мазанкова Л.Н. Совершенствование патогенетической терапии острых кишечных инфекций у детей / Л.Н. Мазанкова, А.А. Павлова // Детские инфекции. - 2006. - №4. - С. 67-69.

3. Волков А.В. Вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний человека и животных, вызванных патогенными и условно-патогенными грамотрицательными микроорганизмами кишечной группы и их экзотоксинами, и способ ее получения (варианты), иммуноглобулиновый препарат (варианты) и способ его получения, иммунобиологический препарат, поликомпонентная вакцина / А.В. Волков, В.А. Алешкин // Патент РФ 2262350; МПК A61K 39/00, A61K 39/112, A61K 39/40, A61P 31/04; 24.12.03.

4. Энтеросорбция - роль энтеросорбентов в комплексной терапии острой и хронической гастроэнтерологической патологии / В.Ф. Учайкин др. Пособие для врачей. - М., 2008. - 24 с.

5. Токмалаев А.К. Применение энтеросорбентов в лечении острых кишечных заболеваний / А.К. Токмалаев // Лечащий врач. - 2005. - №5. - С. 1-6.

6. Новокшонов А.А. Изучение клинической эффективности орального сорбента «Фильтрум» при ОКИ у детей / А.А. Новокшонов, О.Ю. Портных, Н.В. Соколова // Сборник трудов «Применение метода энтеросорбции в практической медицине». М., 2002. - С. 24-31.

7. Биоценоз-сберегающая терапия инфекционных заболеваний кишечника у детей / А.А. Новокшонов и др. // Фарматека. - 2004. - №13 (90). - С. 85-88.

8. Кулемин Л.М. Средство, обладающее иммуномодулирующей, энтеросорбционной, антитоксической и противовоспалительной активностью и способ его получения / Л.М. Кулемин, И.Ю. Чичерин // Патент 2206330 РФ; МПК A61K, A61P; 20.06.03.

9. Антибактериальная активность хитозана и его производных / CH. Куликов и др. // Труды БГУ. Серия: Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. - 2009. - Т. 4, ч. 1. - С. 95-100.

10. Большаков И.Н. Хитозановая энтеросорбция при воспалительном инфильтрате брюшной полости / И.Н. Большаков // Современные наукоемкие технологии. - 2004. - №3. - С. 49-52.

11. Губайдуллина А.А. Получение модифицированных форм интерферона, обладающих пролонгированным действием: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.06 / Губайдуллина Альфия Азаматовна. - Уфа, 2010. - 22 с.

12. Зубарева А.А. Разработка систем доставки активных веществ на основе наночастиц хитозана и его производных: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.06 / Зубарева Анастасия Александровна. - М., 2013. - 24 с.

13. Использование хитозана и его продуктов при воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта / И.Н. Большаков [и др.] // В кн. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение; под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука. - 2002. - С. 280-301.

14. Meckalanos, J.J. Purification of cholerae toxin and its subunits: new methods of preparation and the use of hypertoxinogenic mutants / J.J. Meckalanos, R.J. Collier, W.R. Roming // Infect. Immun. - 1978. - №20. - V. 552-559.

15. Гендон Ю.З. Живая холодоадаптированная гриппозная вакцина: современное состояние / Ю.З. Гендон // Вопросы вирусологии. - 2010. - №1. - С. 4-17.

16. Решетников В.И. Оценка адсорбционной способности энтеросорбентов и их лекарственных форм / В.И. Решетников // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. №5. - С. 28-32.

17. Решетников В.И. Методология разработки лекарственных форм с иммунологической и адсорбционной активностью: дис. … д-ра фарм. наук: 15.00.01 / Решетников Виктор Иванович. - Пермь, 2005. - 403 с.

18. Дурихин К.В. Количественная оценка биологической активности фильтратов культуры холерного вибриона (холерогена) на белых мышах / К.В. Дурихин, А.Е. Попова // ЖМЭИ. - 1974. - №9. - С. 52-56.

19. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.