Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к подвидовой дифференциации и молекулярному типированию штаммов Y. Pestis, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и службах Роспотребнадзора.

Возбудитель чумы - Yersinia pestis отличается сложной внутривидовой структурой, которая включает, согласно отечественной номенклатуре, основной подвид - subspecies (ssp.) pestis и группу неосновных: кавказский - ssp. caucasica, алтайский - ssp. altaica, гиссарский - ssp.v hissarica, улегейский - ssp. ulegeica. Штаммы возбудителя чумы, относящиеся к разным подвидам, отличаются по вирулентности и эпидемической значимости. Так штаммы Y. pestis ssp. pestis (основной подвид) характеризуются высокой вирулентностью для человека и высоким эпидемическим потенциалом. В отличие от них штаммы Y. pestis неосновных подвидов имеют избирательную вирулентность и эпидемически малозначимы. В связи с этим дифференциация подвидов Y. pestis и, в частности детекция среди них высоковирулентных штаммов основного подвида, представляет важную в практическом отношении задачу. Кроме того, выявление принадлежности исследуемых штаммов к одному из пяти подвидов (основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому или улегейскому) позволяет установить их происхождение, а также возможные пути заноса в рамках молекулярно-эпидемиологического мониторинга чумы.

В диагностической практике индикацию штаммов Y. pestis и их подвидовую дифференциацию проводят с учетом различной экспрессии ряда биохимических признаков (ферментация сахаров и многоатомных спиртов, редукция нитратов, продукция изоцитрат-лиазы и др.). Однако большинство фенотипических признаков, применяемых для внутривидового разделения штаммов Y. pestis, отличается вариабельностью, и часто зависит от условий культивирования, качества питательных сред, а также требует выделения культур возбудителя в чистом виде. В связи с этим более надежными являются методы дифференциации, основанные на генетических особенностях штаммов, которые отличаются большим консерватизмом и поэтому их применение дает более стабильные и хорошо воспроизводимые результаты.

В настоящее время для индикации и внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis применяется ряд способов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и мультилокусном секвенировании.

Зарегистрирована тест-система («ГенПест», ТУ8895-005-0189), предназначенная для экспресс-диагностики штаммов Y.pestis методом ПЦР с использованием двух пар праймеров на комплиментарные участки генов caf1 (плазмида pFra) и pla (плазмида pPst). Однако эта система предназначена исключительно для детекции вида Y.pestis, но не для проведения его внутривидовой дифференциации.

Известен способ экспресс диагностики бактерий рода Yersinia, который основан на методе мультиплексной ПЦР с последующим анализом длин амплифицированных фрагментов гена порина - OmpF (патент RU 2385941, опубл. 10.04.2010). Метод позволяет осуществлять одновременную детекцию и дифференциальную диагностику патогенных и непатогенных видов иерсиний, а также видовую идентификацию патогенных для человека видов: Y.pestis, Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Однако этот способ не предназначен для проведения подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis.

Известен способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (патент RU 2425891, опубл. 10.08.2011). Разделение исследуемых штаммов, согласно этому способу, проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов. Предложенный метод позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов и Y.pseudotuberculosis, однако, не разделяет штаммы возбудителя чумы кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов.

Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования (RU 2404256, опубл. 20.11.2010), который предусматривает амплификацию фрагментов генов rhaS и araC, а также определение их нуклеотидных последовательностей. Генотип исследуемого штамма устанавливают по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS и 773 гена araC. Подвидовую принадлежность штамма определяют путем сравнения его генотипа с генотипами штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов.

Также известен способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования (RU 2415948, опубл. 10.04.2011),

предусматривающий определение нуклеотидных последовательностей ряда генов жизнеобеспечения (rhaS, araC, metB, aspA, thiH) с применением секвенационных технологий. Генотип исследуемого штамма устанавливают по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена агаС, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH. По аллелям генов rhaS, агаС, metB, asp А и thiH определяют сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с его последующей подвидовой дифференциацией путем сравнения с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов. Данные методы позволяют определять подвидовую принадлежность штаммов возбудителя чумы, однако, являются трудоемкими, дорогостоящими, а также требуют соответственного технического оснащения и кадрового состава лаборатории.

Известен способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (RU 2332464, опубл. 27.08.2008). Согласно этому методу дифференциацию исследуемых штаммов проводят по размеру амплификатов вариабельной области hutG-YP01967, полученных с помощью праймеров TAN1 и TAN2. Однако недостаток способа заключается в том, что локус hutG-YP01967 расположен в нестабильной области генома Y.pestis, которая может часто утрачиваться у штаммов основного подвида, что делает невозможным их индикацию этим методом. Кроме того, способ сложен в интерпретации результатов и требует использования большой группы референтных штаммов. Другие данные об использовании метода ПЦР для подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis в литературе отсутствуют, как отсутствует и информация о локусах в геноме возбудителя чумы, применение которых позволило бы осуществить такое разделение.

Задачей изобретения является разработка простого в интерпретации, но надежного и эффективного способа быстрой дифференциации штаммов Y.pestis основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов методом ПЦР.

Технический результат заключается в повышении эффективности и сокращении времени подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы.

Заявленный способ основан на использовании в качестве ДНК-мишеней вариабельных участков хромосомной ДНК, локализованных в межгенных пространствах wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов Y.pestis основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов методом полимеразной цепной реакции, который предусматривает выделение ДНК штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией межгенных участков wzyE-

dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065 исследуемого изолята, при этом праймеры на эти гены имеют следующие последовательности нуклеотидов:

wzyE-dapF-S - ACATACGATGGCCGATCATG,

wzyE-dapF-As - CTGATTATGTGGGGCGCT,

YPDSF_0064-YPDSF_0065-S - CTGAAGGGCGAGGAGAGAC,

YPDSF_0064-YPDSF_0065-As - AGGGTGTTGTTGGTTTTGGT;

последующую дифференциацию штаммов проводят путем сравнения размеров амплифицированных фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065 с размерами аналогичных фрагментов, характерных для типичных штаммов основного (151 п.н. и 374 п.н.), кавказского (185 п.н. и 434 п.н.), алтайского и гиссарского (202 п.н. и 374 п.н.), а также улегейского (185 п.н. и 374 п.н.) подвидов.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма Y. pestis проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных пар праймеров на межгенные участки wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065, рассчитанных на основе последовательностей штаммов Y. pestis С092, A1122, KIM10, Antiqua, Nepal516, Harbin35, Z176003, D182038, D106004, Pestoides F, 91001, Angola, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью рассчитанных пар праймеров в ПЦР проводят амплификацию фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065 и определяют размеры полученных ампликонов. Праймеры на межгенные участки wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065 имеют следующий состав:

wzyE-dapF-S - ACATACGATGGCCGATCATG,

wzyE-dapF-As - CTGATTATGTGGGGCGCT,

YPDSF_0064-YPDSF_0065-S - CTGAAGGGCGAGGAGAGAC,

YPDSF_0064-YPDSF_0065-As - AGGGTGTTGTTGGTTTTGGT;

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065 выполняют в следующих условиях: 1 цикл 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 с, 57°С 1 мин, 72°С 45 с и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Определение размеров образованных в ПЦР амплификатов проводят методом электрофореза в 2,5% агарозном геле относительно стандартных маркеров молекулярных масс с размером от 100 до 1000 п.н.

Штаммы Y. pestis основного подвида имеют размеры образуемых в ПЦР амплификатов локусов wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065 соответственно 151 п.н. и 374 п.н.; штаммы кавказского подвида соответственно 185 п.н. и 434 п.н.; штаммы алтайского и гиссарского подвидов 202 п.н. и 374 п.н.; штаммы улегейского подвида 185 п.н. и 374 п.н.

Сущность изобретения поясняется примерами на исследуемых штаммах с неустановленной внутривидовой принадлежностью.

Пример 1. Дифференциация штамма №1 по подвидовой принадлежности.

Выделение ДНК штамма №1 проводят общепринятым способом в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» с предварительным обеззараживанием культуры возбудителя чумы путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 и прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. После обработки мертиолятом натрия к образцу добавляют лизирующий раствор на основе 6М гуанидинтиоизоцианата (в трехкратном объеме) и инкубируют при 65°С в течение 15 мин. Далее выделение генетического материала проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09.

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl2 - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 2,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализируют в УФ-спектре.

Определяют размеры образовавшихся фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065. Они составляют 151 п.н. и 374 п.н., что соответствует размерам фрагментов этих локусов у штаммов Y. pestis основного подвида. Делается вывод о принадлежности исследуемого штамма №1 к основному подвиду.

Пример 2. Дифференциацию штамма №2, по подвидовой принадлежности, проводят аналогично примеру №1.

Размеры образуемых в ПЦР фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065 составляют 185 п.н. и 434 п.н., что соответствует размерам амплификатов этих локусов у штаммов Y. pestis кавказского подвида. Делается вывод о принадлежности исследуемого штамма №2 к кавказскому подвиду.

Пример 3. Дифференциацию штамма №3, по подвидовой принадлежности, проводят аналогично примеру №1.

Размеры образуемых в ПЦР фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065 составляют 202 п.н. и 374 п.н., что соответствует размерам амплификатов этих локусов у штаммов Y.pestis алтайского и гиссарского подвидов. Делается вывод о принадлежности исследуемого штамма №3 к алтайскому или гиссарскому подвидам.

Пример 4. Дифференциацию штамма №4, по подвидовой принадлежности, проводят аналогично примеру №1.

Размеры образуемых в ПЦР фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF_0064-YPDSF_0065 составляют 185 п.н. и 374 п.н., что соответствует размерам амплификатов этих локусов у штаммов Y.pestis улегейского подвида. Делается вывод о принадлежности исследуемого штамма №4 к улегейскому подвиду.

Таким образом, заявленный способ дифференциации штаммов Y.pestis основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов методом ПЦР, основанный на вариабельности нуклеотидной последовательности межгенных участков wzyE-dapF и YPDSF 0064-YPDSF 0065 позволяет быстро и эффективно проводить определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы.