Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАБИЛЬНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ У БЕРЕМЕННЫХ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к методам медицинской диагностики, и может быть использовано для диагностики стабильности эритроцитов у беременных с вирусными заболеваниями, такими как цитомегаловирусная инфекция.

Известно, что фосфолипиды и входящие в их состав насыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты являются основной составной частью мембраны эритроцита (2, 6). Деструкция фосфолипидного слоя и жирнокислотных остатков, вызванная высокой фосфолипазной активностью, приводит к увеличению микровязкости мембран, трансформации эритроцитов, что в свою очередь вызывает преждевременный гемолиз клеток, развитие застойных явлений в микроциркуляторном русле и, как следствие, гипоксию (1, 3, 8).

Особенно важно выделять неустойчивое предгемолитическое состояние эритроцитов у беременных с вирусными инфекциями герпетической группы (ВПГ-1, 2, ЦМВ) для профилактики развития внутриутробной гипоксии плода, когда требуется сохранить здоровье будущего ребенка.

Выявление нестабильного предгемолитического состояния эритроцитов имеет решающее значение для профилактики гемической гипоксии. Однако реальные возможности оценки данного состояния ограничены отсутствием адекватных способов диагностики. Известные способы оценки устойчивости мембран эритроцитов основаны на анализе данных показателей периферической крови, например осмотической, кислотной и(или) механической стойкости эритроцитов. Однако все известные способы могут выявить только уже сформированные морфофункциональные изменения эритроцитов, являющиеся критерием патологического состояния, в том числе гипоксии. Это приводит к тому, что гипоксия у беременных переходит в клиническую форму, сопровождается угрозой развития внутриутробной гипоксии плода, может вызвать осложнения беременности и требует адекватной терапии.

Известный способ оценки осмотической резистентности эритроцитов (4), оценивающий морфофункциональное состояние эритроцитов, основан на определении кинетики гипоосмотического (0,55% NaCl) гемолиза эритроцитов. Такая оценка морфофункционального состояния эритроцитов в известном способе является основой для диагностики некоторых форм гемолитических анемий.

Недостатком известного способа является то, что он не позволяет провести раннюю диагностику нестабильного предгемолитического состояния эритроцитов и, таким образом, диагностировать нарушение структуры мембран эритроцитов и прогнозировать развитие гемической гипоксии.

Мы предлагаем способ диагностики стабильности мембран эритроцитов, включающий выявление в сыворотке крови беременных TNFα и расчет показателя коэффициента соотношения ω-6/ω-3 жирных кислот, что имеет значение для определения скрытых повреждений клеточных мембран и характера обменных процессов организма в целом.

ω-3 и ω-6 жирные кислоты относят к классу полиненасыщенных жирных кислот с противоположным эффектом по воздействию на обменные процессы. ω-3 жирные кислоты (α-линоленовая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая) предотвращают развитие тромбоэмболических осложнений, угрозу прерывания беременности, улучшают маточно-плацентарное кровообращение, ω-6 жирные кислоты (линолевая, арахидоновая), являясь предшественниками провоспалительных эйкозаноидов (лейкотриены, тромбоксаны), усиливают микроциркуляторные расстройства в тканях, вызывают гипоксию и метаболические нарушения (7, 10).

Нашими исследованиями показано, что при герпес-вирусной инфекции в эритроцитах периферической крови беременных увеличивается количество ω-6 полиненасыщенных жирных кислот при одновременном уменьшении содержания ω-3 кислот, что свидетельствует о конформационных перестройках клеточных мембран (5). Важным следствием изменения содержания в эритроцитах периферической крови беременных при герпес-вирусной инфекции ω-3 и ω-6 жирных кислот является изменение вязкостных свойств мембран, повышенной трансформации клеток и их усиленного разрушения, однако для целей диагностики стабильности эритроцитов при цитомегаловирусной инфекции и действии на мембраны TNFα выявленные закономерности в виде расчета коэффициента соотношения ω-6 (линолевая, арахидоновая) и ω-3 (α-линоленовая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая) полиненасыщенных жирных кислот еще не использовались.

Задачей изобретения явилась разработка способа диагностики стабильности эритроцитов у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции.

В основе предлагаемого способа лежит повышение точности оценки снижения стабильности эритроцитов к токсическому действию цитомегаловируса на уровне мембранного комплекса, что достигается путем определения в сыворотке крови беременных TNFα и расчета коэффициента соотношения ω-6/ω-3. Чувствительность способа диагностики нестабильного состояния мембран эритроцитов повышается и позволяет на ранней стадии клинических проявлений прогнозировать нарушения структуры клеток и развитие гемической гипоксии у беременных. Практическая значимость способа определяется возможностями формирования групп риска и определения показаний к проведению ранней профилактики гемической гипоксии у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения диагностических критериев была исследована периферическая кровь 25 беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции и 25 беременных, не болевших на всем протяжении гестации. У обследуемых беременных производили забор крови из вены в пробирку с гепарином (1:25), центрифугировали, отбирали плазму, в которой методом иммуноферментного анализа определяли IgM и титр антител IgG к цитомегаловирусу, содержание TNFα. Осадок эритроцитарной массы использовали для выявления методом газожидкостной хроматографии ω-6 и ω-3 полиненасыщенных жирных кислот. Метилирование жирных кислот осуществляли по методу Carren J.P. и Dubacy J. (9). Обсчет и идентификацию полученных пиков выполняли с помощью программно-аппаратного комплекса «Хроматек Аналитик 2,5» по мере удерживания с использованием стандартов фирмы «Supelco» (USA). Количественный расчет хроматограмм проводили методом внутренней нормализации путем определения площадей пиков анализируемых компонентов и их доли в % к общей сумме площадей пиков метилированных продуктов высших жирных кислот. Полученные результаты содержания ω-6 и ω-3 использовали для вычисления коэффициента их соотношения (K) по формуле: К=Σω-6/Σω-3, где Σω-6 - сумма показателей линолевой и арахидоновой кислот, %; 2 Σω-3 - сумма показателей α-линоленовой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот, %. При значениях TNFα 110±1,97 пг/мл и коэффициента соотношения Σω-6/Σω-3 (K) больше 0,67 диагностируют нестабильное состояние мембран эритроцитов и с вероятностью 95% прогнозируют развитие гемической гипоксии.

Предлагаемый способ позволил прогнозировать развитие нестабильного состояния эритроцитов у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции на ранних стадиях клинических проявлений гемической гипоксии.

Правильность выводов и возможность диагностики нестабильного состояния эритроцитов для оценки развития гемической гипоксии была подтверждена результатами комплексного обследования 25 беременных с цитомегаловирусной и 25 беременных без проявлений заболевания в период беременности. У беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции, которое подтверждалось наличием IgM и в динамике через 10 дней высоким 1:1600 титром антител IgG, отмечалось увеличение содержания в сыворотке крови TNFα до 110±1,97 пг/мл и в мембранах эритроцитов ω-6 жирных кислот: линолевой до 5,43±0,22% и арахидоновой до 3,26±0,12% при снижении ω-3 жирных кислот: α-линоленовой до 0,13±0,04%, эйкозапентаеновой 1,10±0,05% и докозагексаеновой 6,10±0,18%, коэффициент соотношения Σω-6/Σω-3 (K) составил 1,19±0,07, что позволило с 95% вероятностью диагностировать нестабильное состояние эритроцитов. У беременных без проявлений заболевания в период гестации содержание в сыворотке крови TNFα составило 20±0,86 пг/мл и в мембранах эритроцитов ω-6 жирных кислот линолевой не превышало значений 4,81±0,16% и арахидоновой до 2,94±0,10%. Показатели ω-3 жирных кислот α-линоленовой определялось на уровне 0,22±0,02%, эйкозапентеновой 1,19±0,08% и докозагексаеновой 8,54±0,27%. Коэффициент соотношения Σω-6/Σω-3 (K) составил 0,67±0,04.

Таким образом, представленные результаты показывают, что при содержании в сыворотке крови TNFα 110±1,97 пг/мл и значениях коэффициента соотношения K=Σω-6/Σω-3 больше 0,67 определяют нестабильное состояние эритроцитов, что подтверждает диагностическую значимость определения данного коэффициента для прогнозирования гемической гипоксии.

Представленный способ повышает чувствительность методов оценки нестабильного состояния эритроцитов и позволяет на ранних стадиях, до клинических проявлений, прогнозировать с вероятностью 95% развитие гемической гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции.

Пример

Беременная Б., 25 лет, поступила в акушерское отделение патологии беременных при ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН на сроке гестации 12 недель с обострением цитомегаловирусной инфекции. По результатам первоначального обследования в периферической крови выявлен IgM и в динамике через 10 дней определено четырехкратное нарастание титра антител IgG к цитомегаловирусу до 1:1600. Содержание TNFα в сыворотке крови на момент поступления составило 111 пг/мл. При исследовании жирнокислотного состава липидов мембран эритроцитов выявлено, что содержание представителей ω-3 жирных кислот α-линоленовой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой составило 0,14%, 1,05% и 6,07% соответственно. Показатели ω-6 жирных кислот линолевой и арахидоновой определялись на уровне 5,4% и 3,2% соответственно. В соответствие с предлагаемой формулой произведен расчет коэффициента соотношения Σω-6/Σω-3, который составил K=5,4+3,2/0,14+1,05+6,07=1,18. Диагностировано нестабильное состояние эритроцитов и сделан прогноз развития гемической гипоксии, который подтвердился при проведении дополнительных клинических исследований и определялся в снижении общего числа эритроцитов до 3,4·10¹², количества дискоцитов до 77% и повышении доли эхиноцитов и дегенеративных форм соответственно до 14% и 6%, уменьшении pO₂ артериальной крови до 74 мм рт.ст., что подтвердило точность применяемого способа.

Литература

1. Буриходжаева Н.К., Каримова Д.Х., Баширова Н.С. Фосфолипидный состав эритроцитов матери и плода при беременности, осложненной гестозом // Медицинский журнал Узбекистана. 1991. №5. С.56-59.

2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 256 с.

3. Ворожцова С.И., Овчинников В.В., Садков С.А. Показатели вязкости крови у женщин репродуктивного возраста с неосложненным течением беременности // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. №10. С.6.

4. Идельсон Л.И. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И.А.Кассирского. М.: Медицина, 1970. с.401.

5. Ишутина Н.А. Взаимосвязь изменений ω-3 и ω-6 полиненасыщенных жирных кислот при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Фундаментальные исследования. 2010. №10. С.55-62.

6. Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н. Липиды. Киев: Вища школа, 1985. 247 с.

7. Сидельникова В.М. Применение омега-ЗПНЖК для профилактики и комплексного лечения тромбоэболических нарушений при беременности // Русский медицинский журнал. 2008. Т.16, №6. С.1-6.

8. Титов В.Н., Лисицин Д.М. Жирные кислоты. Физическая химия, биология и медицина. М. - Тверь: ООО «Издательство триада», 2006. 672 с.

9. Carren J.P., Dubacy J. Adaptacion of a micro-seale method to the micro-seale for fatty acid methyl trausestenif: cation of biological lipid extracts // Chromatography. 1978. Vol.151. P.384-390.

10. Elias S.L., Innis S.M. Infant plasma trans, n-6 and n-3 fatty acid and conjugated linolic are related to maternal plasma fatty acid, length of gestation and birth weight and length // American Journal Clinical Nutrition. 2008. V.87, №4. P.887-895.