Способ оценки угрозы для формирования органов плода при увеличении в плаценте содержания 17-гидроксипрогестерона на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции

1. Цель изобретения - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на содержание 17-гидроксипрогестерона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, приводящей к нарушению формирования органов плода в период гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке метода, позволяющего оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на формирование органов плода на фоне увеличения содержания 17-гидроксипрогестерона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.

3. Раскрытие изобретения

Во время гестации глюкокортикоиды продуцируются из холестерина через образование ряда предшественников, в том числе и 17-гидроксипрогестерона. Поэтому изменение количества 17-гидроксипрогестерона приведет к нарушению формирования глюкокортикоидных гормонов в фетоплацентарной системе. В третьем триместре беременности глюкокортикоиды необходимы для развития надпочечников плода, созревания легких. Они индуцируют дифференцировку альвеолярных клеток, синтез сурфактанта и его выделение в альвеолы. Кортизол индуцирует созревание ферментных систем печени плода, включая ферменты глюконеогенеза и аминотрансферазы. Глюкокортикоиды стимулируют созревание β-клеток поджелудочной железы, созревание эпителия тонкой кишки и активность щелочной фосфатазы плода [8]. Увеличение активности глюкокортикоидных гормонов создает угрозу для формирования органов плода в период гестации.

4. Новая техническая задача

Определить уровень содержания 17-гидроксипрогестерона в синцитиотрофобласте ворсинок при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации с целью оценки угрозы для формирования органов плода во время беременности.

5. В доступной литературе имеются упоминания об исследовании 17-гидроксипрогестерона иммунологическими методами [4, 5, 9], а также методами флуорометрии [3, 7] и высокоэффективной жидкостной хроматографии [7, 10]. При беременности содержание 17-гидроксипрогестерона анализируется в плазме периферической крови для изучения гиперандрогении методом ИФА [2], в гомогенате плаценты метаболизм стероида изучается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрофотометрии [6, 11]. Недостатком вышеупомянутых методов является необходимость дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и реактивов. Биохимические и иммунологические методы не дают представления о месте локализации вещества.

В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1. Анализ содержания 17-гидроксипрогестерона проводится с помощью гистохимической реакции, в качестве субстрата для которой используется 17-гидроксипрогестерон. 2. Изменения содержания 17-гидроксипрогестерона происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.

6. Осуществление изобретения

7.1. Обследованы 36 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

7.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

7.3. Активность 17-гидроксипрогестерондегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты роженицы следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАДФ [1]. Субстратом служит 2 мМ раствор 17-гидроксипрогестерона «Sigma» (США). Для его приготовления 6 мг 17α-гидроксипрогестерона растворяют в 10 мл N,N-диметилформамида. Инкубационный раствор готовится на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 ммоль, НАДФ⁺ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 ммоль.

Состав инкубационной среды:

0,1 М фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;

нитросиний тетразолий - 1 мг;

НАДФ⁺ - 1 мг;

2 мМ раствор 17-гидроксипрогестерона - 0,1 мл.

7.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-м нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора 17-гидроксипрогестерона адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).

7.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значении М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. На гистохимических препаратах плаценты рожениц, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается увеличение активности реакции, отражающей содержание 17-гидроксипрогестерона до 42,б±3,08 пикселей/мкм² (фигура 1) (контроль - 29,2±2,11 пикселей/мкм² (фигура 2)).

Таким образом, при нарастании титра антител класса G к цитомегаловирусу 1:1600 и повышении содержания 17-гидроксипрогестерона в плаценте до 42,б±3,08 пикселей/мкм², создается угроза для формирования органов плода в период гестации.

Литература

1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.

2. Суплотова Л.А., Храмова Е.Б., Старкова О.Б., Суплотов С.Н., Южакова Н.Ю., Фомина С.В. Референтные значения 17-гидроксипрогестерона и дегидроэпиандростерон-сульфата в период гестации // Проблемы эндокринологии. 2007. Т. 53, №4. С.19-22.

3. Boudi A., Giton F., Galons Н., Eulry В., Villette J.M., Soliman H., Boudou P., Fiet J. Development of a plasma 17-hydroxyprogesterone time resolved-fluorescence immunoassay involving a new biotinylated tracer // Steroids. 2000. Vol. 65, №2. P. 103-108.

4. Castracane V.D., Gimpel T. Comparison of three methods for 17-hydroxyprogesterone // J. Clin. Lab. Anal. 1997. Vol. 11, №4. P. 179-185.

5. Erhardt E., Solyom J., Homoki J., Juricskay S., Soltesz G. Correlation of blood-spot 17-hydroxyprogesterone daily profiles and urinary steroid profiles in congenital adrenal hyperplasia // J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 2000. Vol. 13, №2. P. 205- 210.

6. Fokina V.M., Zharikova O.L., Hankins G.D., Ahmed M.S., Nanovskaya T.N. Metabolism of 17-alpha-hydroxyprogesterone caproate by human placental mitochondria // Reprod. Sci. 2012. Vol. 19, №3. P. 290-297.

7. Katayama M., Nakane R., Matsuda Y., Kaneko S., Hara I., Sato H. Determination of progesterone and 17-hydroxyprogesterone by high performance liquid chromatography after pre-column derivatization with 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionohydrazide // Analyst. 1998. Vol. 123, №11. P. 2339-2342.

8. Korgun E.T., Ozmen A., Unek G., Mendilcioglu I. The effects of glucocorticoids onfetal and placental development. In: Glucocorticoids / Eds. X. Qian. Rijeka, Croatia: InTech, 2012. P. 305-336.

9. Nahoul K. Plasma 17-hydroxyprogesterone determination with two commercial immunoassays // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1994. Vol. 50, №3-4. P. 197-203.

10. Saisho S., Shimozawa K., Yata J. Changes of several adrenal -4-steroids measured by HPLC-UV spectrometry in neonatal patients with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Horm. Res. 1990. Vol. 33, №1. P. 27-34.

11. Yan R., Nanovskaya T.N., Zharikova O.L., Mattison D.R., Hankins G.D., Ahmed M.S. Metabolism of 17alpha-hydroxyprogesterone caproate by hepatic and placental microsomes of human and baboons // Biochem. Pharmacol. 2008. Vol. 75, №9. P. 1848-1857.