Способ оценки снижения оксигемоглобина при индуцирующем действии цитомегаловирусной инфекции на структуру гемоглобина эритроцитов, приводящем к формированию телец Гейнца

1. Цель изобретения - изучить механизм индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на гемоглобин эритроцитов, приводящий к формированию телец Гейнца и снижению оксигемоглобина.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке метода, позволяющего выявить в эритроцитах периферической крови при обострении цитомегаловирусной инфекции телец Гейнца, приводящих к снижению содержания оксигемоглобина.

3. Раскрытие изобретения

Тельца Гейнца впервые описаны автором в 1890 [5], представляют округлые глыбкообразные структурные элементы в эритроцитах, расположенные обычно на их периферии. Образование телец Гейнца связано с глубокими дегенеративными изменениями в эритроцитах, в основном связанными с повреждением молекул гема [8]. При появлении телец Гейнца наблюдается подавление оксигенации гемоглобина и увеличивается содержание метгемоглобина. Обнаруживаются тельца Гейнца при воздействии на гемоглобин факторов, приводящих к метгемоглобинобразованию. Исчезновение этих телец вместе с эритроцитами происходит через несколько дней после прекращения токсического воздействия на эритроциты. Таким образом, в основе образования телец Гейнца лежит окисление тиоловых групп глобина и переход гемоглобина в метгемоглобин, которое происходит в связи с окислением Fe²⁺ в Fe³⁺. Процесс окисления зависит от наличия в эритроците восстановленного глютатиона (Г-SH).

Восстановленный глютатион защищает [1] тиоловые группы глобина и препятствует инактивации тиоловых ферментов и сульфгидрильных групп в мембранах эритроцитов.

4. Новая техническая задача - найти новый метод оценки появления телец Гейнца как свидетеля нарушения оксигенации гемоглобина при обострении в организме хронической цитомегаловирусной инфекции, приводящей к снижению оксигенации гемоглобина.

5. Основной причиной формирования телец Гейнца в эритроцитах периферической крови многие авторы [3, 4, 6, 7, 9] считали происходит вследствие токсического воздействия на эритроцитарный гемоглобин N-нитропроизводных элементов, которые и вызывали метгемоглобинобразование при коагуляции гемоглобина. Однако изучая это явление, мы обнаружили, что белки gp64 цитомегаловируса, вступая в контакт с гликофорином мембран эритроцитов, приводят к дезорганизации белково-липидный слой мембран эритроцитов, снижают содержание в них активность SH-групп и стимулируют выработку перекисей жирных кислот, которые являются сильным токсичным фактором, разобщающим глобин от гема, одновременно подавляя активность глютатионредуктазы [1]. В результате на время высокого содержания в крови антигенов ЦМВ в эритроцитах происходит денатурация гемоглобина и появляется большое количество телец Гейнца, которые являются свидетелями снижения оксигенации гемоглобина.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 5 беременных на третьем триместре гестации при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции на 25-26 неделях гестации. Отмечалось тяжелое течение беременности в связи с диагностированием у них высоковыраженной анемии. Количество оксигемоглобина в периферической крови колебалось от 84 до 86%. В периферической крови на мазках, окрашенных метиленовым фиолетовым, обнаружены крупных размеров тельца Гейнца.

6.2. Диагноз обострения хронической цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.3. Глутатионредуктаза определялась спектрофотометрически с помощью наборов реагентов «Sentinel Diagnostics» на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).

6.4. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [2].

6.5. Выявление телец Гейнца осуществляли следующим образом:

1 г метилового фиолетового растворяют в 100 мл 0,6% раствора натрия хлорида. На предметное стекло наносят каплю этого раствора и в нее вносят каплю свежевзятой крови из пальца. Накрывают эту смесь покровным стеклом и в закрытой чашке Петри содержат 1-2 часа при комнатной температуре. Края покровного стекла, чтобы не происходило испарения красителя, окантовывали расплавленным парафином. Через 2 часа препарат изучали под цифровым микроскопом и документировали содержание в эритроцитах телец Гейнца (фигура 1).

7. Полученные данные

У беременных с выявленным обострением хронической цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации при выявлении признаков тяжелой анемии с уровнем оксигемоглобина 84-86% забирали кровь для определения в эритроцитах глутатионредуктазы и отмечали, что ее количество резко у этих беременных снижалось - до 3,95±0,06 Ед/гНb (контроль - 8,20±0,09 Ед/гНb). В окрашенных метиловым фиолетовым эритроцитах содержалось от 2 до 5 телец Гейнца (фигура 1). В норме, если они встречаются, их количество бывает не более 1-2 на один эритроцит. Однако это практически бывает очень редко. Следовательно, обострение ЦМВИ с высоким титром антител может привести к подавлению активности глутатионредуктазы до 3,95 Ед/гНb, на фоне чего происходит денатурация гемоглобина и формирование телец Гейнца, создавая снижение оксигенации гемоглобина до 84,0±2,9%, что приводит к формированию гемолитической анемии на фоне титра антител IgG к цитомегаловирусу 1:1600.

Литература

1. Луценко М.Т., Андриевская И.Α., Кутепова О.Л. Морфофункциональная характеристика глутатионового цикла эритроцитов периферической крови беременных, перенесших в период гестации обострение цитомегаловирусной инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. Т. 157, №2. С. 246-250.

2. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. М.: Медицина. 1969. 337 с.

3. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. Пер. с англ. М.: СПб изд. Бином - «Невский Диалект». 2000 г.

4. Han Т.Н., Qamirani Ε., Nelson A.G., Kuo L. Regulation of nitric oxid consumption by hypoxic red blood cells. Proc. Nate. Acad. USA. 2003. Vol.100. P. 12504-12509.

5. Heinz R. Morphologische Verunderungen des rotten Blutkurperchen durch Giffe. Virchow's Archiv fur pathalogische Anatomie and Physiologie and fur klinische Medizin. Berlin. 1890. Vol.122. S. 112-116.

6. Lukens J.N. Unstable Hemoglobin Disease Wintrobe's clinical Hematology Edit J.P. Greer, J. Foereter 11^th edition 2004. P. 1313-1318.

7. Pearson W., Bocmans H., Bettqer W., Mc Bride B.W. Accociation of maximum voluntary dietary intake of freeze-dried garlic with Heinz body anemia in horses // Amer. J. Vet. Res. 2005. Vol.66, №3. P. 457-465.

8. Scott J., Haut Α., Cartwright G., Wintrobe M. Congenital hemolytic disease associated with red cell inclusion bodies, abnormal pigment metabolism and an electrophoretic hemoglobin abnormality // Blood. 1960. Vol.16. P. 1239-1252.

9. Vaugh M.W., Huang K., Kuo L., Liao J.C. Erythrocyte consumption of nitric oxide: Competition and model analysis. Nitric Oxide-Biol. Ch. 2001. Vol.5. P. 18-31.