Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ "СУХОЙ" ФОРМЫ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛЯРНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ

Изобретение относится к медицине, а точнее к офтальмологии, и может быть использовано для лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации.

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) - одно из самых распространенных и малоизученных глазных заболеваний, являющееся основной причиной полной потери зрения у людей старше 60 лет в индустриально развитых странах. По данным Всемирной организации здравоохранения 25-30 миллионов человек в мире страдают ВМД. Ввиду постоянного старения общества ВМД является одной из серьезных медицинских и социальных проблем. Наиболее распространенной клинической формой ВМД является неэкссудативная или «сухая» форма, встречающаяся в 90% случаев и характеризующаяся медленным прогрессирующим снижением зрения (Т.Н.Киселева, Г.С.Полунин, Э.Г.Елисеева и др. Современные аспекты патогенеза и клиники возрастной макулярной дегенерации. // Офтальмология. - 2005. - Т.2. - №1).

Существующие методы лечения «сухой» формы возрастной макулярной дегенерации (Киселева Т.Н., Лагутина Ю.М., Кравчук Е.А. и др. Комплексное лечение возрастной макулярной дегенерации с применением препарата Фезам. // Офтальмология. - 2005. - № 2. - С.63-67) отличаются непродолжительностью достигаемого эффекта.

Одним из перспективных методов лечения дистрофической патологии сетчатки может явиться применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК), однако такие методы еще недостаточно разработаны.

Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток; могут интегрироваться в патологически измененные участки сетчатки и образовывать клетки с ретинальным фенотипом. В офтальмологии терапевтический потенциал стволовых клеток изучался на животных с наследственной ретинальной патологией, близкой к пигментному ретиниту человека (Lund et al. Subretinal transplantation of genetically modified human cell lines attenuates loss of visual function in dystrophic rats. // PNAS. - 2001. - V.98. - №.17. P.9942-9947; Rander et al. Light-driven retinal ganglion cell responses in blind rd mice after neuronal transplantation. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2001. - V.42. - P.1057-1065; Woch et al., 2001; Sagdullaev et al. Retinal transplantation-induced recovery of retinotectal visual function in rodent model of retinitis pigmentosa. // Invest. Ophthal. Vis. Sci - 2003. - V.44. - P.1686-1695).

Хотя мезенхимальные стволовые клетки взрослого организма обладают более ограниченным потенциалом дифференцировки, чем эмбриональные стволовые клетки, получаемые при культивировании клеток бластоцисты, их применение более безопасно. Кроме того, с точки зрения этики, они являются более приемлемым для клинического использования материалом.

Существенной проблемой клеточной терапии является направленная доставка стволовых клеток к патологическому очагу и удержание их в нем в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта.

Задачей изобретения является повышение эффективности лечения возрастной макулярной дегенерации.

Техническим результатом является улучшение или стабилизация зрительных функций.

Технический результат достигается за счет того, что:

1. Используют трехкомпонентный комплекс, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который прочно скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

2. Транслоцирование МСК, меченных магнитными микрочастицами, в биологический или синтетический мелкопористый материал в сочетании с плотным прикреплением к полимерному магнитному материалу с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием обеспечивает глубокое проникновение МСК в слои биологического или синтетического мелкопористого материала, удержание и равномерное распределение МСК в области патологического очага при экстрасклеральной имплантации трехкомпонентного комплекса в проекции макулярной зоны в течение времени, необходимого для достижения лечебного эффекта, за счет взаимодействия магнитных полей микрочастиц и магнитного материала.

3. Экстрасклеральное введение трехкомпонентного комплекса в проекции макулярной зоны сопровождается направленной избирательной адгезией МСК в области патологического очага, что способствует активации репаративных процессов за счет приживления трансплантированных стволовых клеток в непосредственной близости от поврежденного участка.

Возможность подобных процессов для эмбриональных стволовых клеток и для стволовых клеток взрослого организма показана в экспериментах на животных (Lamba D.A., Karl M.O., Ware C.B., Reh T.A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells // PNAS, 2006, v.103, n.34, pp.12769-12774. Meyer J.S, Katz M.L, Maruniak J.A, Kirk M.D. Embrionic stem cell-derived neural progenitors incorporate into degenerating retina and enhance survival of host photoreceptora // Stem Cells, 2006, v.24, n.2, pp.274-283. Fiedlander M. Fibosis and diseases of the eye // J. Clin. Invest., 2007, v.117, n.3, pp.576-586), хотя многие из механизмов реализации терапевтического эффекта изучены не до конца.

Способ осуществляется следующим образом.

На предварительном этапе подготавливают трехкомпонентный комплекс, содержащий МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический или синтетический мелкопористый материал, который скреплен с полимерным магнитным материалом с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

МСК выращивают в культуре клеток костного мозга, взятых у пациента во время диагностической пункции из грудины или подвздошной кости (объем - 0,5-1,0 мл). Выращивание культуры проводят в специальном боксе для клеточных культур с использованием следующего оборудования - центрифуга с одноразовыми стерильными центрифужными пробирками на 50 мл, термостат воздушный, ламинарный бокс, инвертированный и обычный микроскопы, автоматические пипетки, баллоны с углекислым газом и воздухом, камеры Горяева для подсчета концентрации клеток. Для культивирования клеток исходного костного мозга используют стерильные одноразовые пластиковые культуральные флаконы с площадью дна в 25 и 150 см². При размножении МСК используют следующие среды и растворы: среда RPMI-1640, среда 199, антибиотики: пенициллин, амфотерицин, - раствор L-глютамина, эмбриональная телячья сыворотка. За 12-14 последовательных удвоений (в течение 25-30 суток) из исходного количества недифференцированных МСК, содержащихся в полученном пунктате костного мозга пациента и составляющем примерно 10³ клеток, продуцируется примерно (1-2)×10⁷ МСК, необходимых для проведения успешной трансплантации стволовых клеток.

Магнитные частицы (d=2,8 мкм) вводят в цитоплазму мезенхимальных стволовых клеток по следующей методике. По достижении 80-90% конфлюентности к культуре МСК добавляют суспензию магнитных частиц. Магнитные частицы предварительно обрабатываю поверхностно-активными веществами для создания условий проникновения в цитоплазму клетки. Клетки инкубируют с частицами 24 ч в CO2-инкубаторе. После инкубации культуральную среду меняют и клетки 5-кратно отмывают от свободных магнитных частиц раствором Хенкса. Эффективность мечения МСК магнитными частицами по данной технологии составляет порядка 90%. Жизнеспособность стволовых клеток составляет 95%.

Готовый трехкомпонентный комплекс должен иметь форму круга диаметром 6 мм. Для этого выполняют заготовку в форме круга диаметром 6 мм из полимерного магнитного материала системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл с многополюсным реверсивным намагничиванием. Толщина магнитного материала - 0,3 мм. Намагничивание полимерного магнитного материала может быть произведено, например, как описано в патенте РФ №2187162.

Из биологического материала, например, твердой мозговой оболочки или склеры, или коллагена, или аллопланта, или из синтетического мелкопористого материала, например, гидрогеля или дигеля, или полиэфирного полотна, или силиконовой губки и т.п. выполняют заготовку в форме круга диаметром 6 мм, соответствующую заготовке из полимерного магнитного материала.

МСК, меченные магнитными микрочастицами, наслаивают на поверхность заготовки из биологического синтетического мелкопористого материала. Затем под чашку Петри с наслоенными на материал МСК, меченными магнитными микрочастицами, подводят внешнее магнитное поле с напряженностью 30 мТл. При этом размер и форма внешнего магнита соответствует размеру и форме заготовки из биологического или синтетического материала. Таким образом, между внешним магнитом и МСК, содержащими магнитные частицы, находится биологический или синтетический мелкопористый материал. МСК, содержащие магнитные частицы, быстро и глубоко транслоцируются в слои биологического или синтетического мелкопористого материала под действием магнитного поля. Их закрепление и распластывание происходит в течение 1-1,5 часов после нанесения. Закрепленные клетки прочно удерживаются в слоях пористого материала даже в токе культуральной жидкости, что моделировалось в эксперименте с использованием перистальтического насоса. Клетки, содержащие магнитные микрочастицы, пролиферируют, полностью покрывая поверхность биологического или синтетического мелкопористого материала, что доказывает сохранение функциональных свойств МСК.

В завершении полученную структуру «МСК - биологический или синтетический мелкопористый материал» прочно скрепляют, например, при помощи шовной фиксации или биологического клея с заготовкой из полимерного магнитного материала.

Трехкомпонентный комплекс имплантируют экстрасклерально в проекции макулярной зоны следующим образом. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняют разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формируют туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводят трехкомпонентный комплекс, при этом с помощью шпателя производят склерокомпрессию для локализации положения комплекса при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. По завершении имплантации конъюнктиву ушивают непрерывным швом.

Изобретение поясняется следующими данными.

Под наблюдением находилось 7 пациентов (7 глаз) с «сухой» формой ВМД в возрасте от 60 до 68 лет. Острота зрения до лечения у пациентов варьировала от 0,08 до 0,12.

Пациенты были пролечены по предложенному способу.

Использовали трехкомпонентные комплексы в форме круга диаметром 6 мм, содержащие МСК, меченные магнитными микрочастицами, транслоцированные в биологический материал: твердую мозговую оболочку или склеру, или коллаген, - или синтетический мелкопористый материал: гидрогель или дигель, или полиэфирное полотно, или силиконовую губку, - который был прочно скреплен при помощи шовной фиксации или биологического клея с полимерным магнитным материалом системы самарий-кобальт или ниодим-железо-бор с индукцией постоянного магнитного поля 1,5 мТл, с многополюсным реверсивным намагничиванием.

Комплексы имплантировали экстрасклерально в проекции макулярной зоны. В верхненаружном квадранте в 4 мм от лимба выполняли разрез конъюнктивы длиной 6 мм концентрично лимбу и с помощью шпателя формировали туннель в субтеноновом пространстве по направлению к заднему полюсу глаза. В туннель вводили трехкомпонентный комплекс, при этом с помощью шпателя производили склерокомпрессию для локализации его положения при постоянном контроле с помощью бинокулярного офтальмоскопа. По завершении имплантации конъюнктиву ушивали непрерывным швом.

Через 12 месяцев после проведенного лечения во всех случаях острота зрения повысилась на 0,1-0,35, отмечено повышение фовеальной светочувствительности сетчатки по данным компьютерной периметрии, а также увеличение амплитуды а-волны и б-волны по данным макулярной электроретинограммы, которое свидетельствовало о повышении функциональной активности сетчатки. При исследовании гемодинамики у всех пациентов отмечалось увеличение средней скорости кровотока в глазничной артерии, центральной артерии сетчатки и в задних коротких цилиарных артериях.

Полученные результаты оставались стабильными в течение всего периода наблюдения. Сроки наблюдения составили от 12 до 36 месяцев.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает улучшение или стабилизацию зрительных функций у пациентов с «сухой» формой возрастной макулярной дегенерации.