Результат интеллектуальной деятельности: Способ моделирования отморожения кожных покровов в гипоксических условиях

Изобретение относится к медицине, а именно экспериментальной биологии, и может быть использовано для моделирования отморожения кожных покровов в гипоксических условиях.

Изучение медико-биологических проблем, связанных с освоением территории Крайнего Севера является актуальной задачей реализации оборонных и социально-хозяйственных проектов правительства РФ. Одной из важнейших проблем, требующих пристального внимания является воздействие крайне низких температур на организм человека в арктических условиях.

Следует особо отметить, что переохлаждение и обморожение в условиях Крайнего Севера имеет ряд существенных особенностей. Так, наряду с критически низкими температурами у людей, находящихся в условиях Арктики, наблюдается развитие полярно-гипоксического синдрома, который характеризуется тем, что у практически здоровых лиц происходит развитие гипервентиляции легких в сочетании с низким коэффициентом использования кислорода. Все это, в сочетании с низкими температурами окружающей среды, приводит к развитию тканевой гипоксии.

Следует особо отметить, что тканевая гипоксия резко усиливается у пострадавших с ожогами и ранениями мягких тканей, а также у лиц с обморожениями и общим переохлаждением, что обусловлено повышением энергетического обмена, нарушением в работе респираторного тракта, повышенным уровнем стрессорных гормонов в условиях Крайнего Севера.

Отморожения являются одним из наиболее тяжелых видов термической травмы, зачастую приводящих к инвалидизации пострадавших. Криоповреждение кожи и слизистых оболочек происходит, когда длительное воздействие сверхнизкой температуры создает условие для замерзания тканей. Данная патология наиболее распространена среди альпинистов, солдат, работающих в холодных условиях Крайнего Севера, лиц, случайно попавших в условия воздействия низких температур (Candler W.H. and Ivey Н. Cold weather injuries among U.S. soldiers in Alaska: a five-year review.Mil Med. 1997; 162: 788-791; DeGroot D.W., Castellani J.W., Williams J.O., and Amoroso P.J. Epidemiology of U.S. Army cold weather injuries, 1980-1999. Aviat Space Environ Med. 2003; 74: 564-570; Vaughn P.B. Local cold injury - menace to military operations: a review. Mil Med. 1980; 145: 305-311). Обморожение чаще всего локализовано на пальцах рук/ног, на ступнях, участках носа, щек и ушей. Это обусловлено тем, что они обнажены, находятся на периферии и их трудно защитить. В патогенезе отморожения следует выделить следующие основные звенья: рефлекторный спазм сосудов, что приводит к снижению кровотока и, в конечном итоге, к развитию микрососудистого тромбоза. На клеточном уровне цитоплазматическое образование ледяных кристаллов вызывает конформационные изменения структуры белковых молекул и приводит к повреждению мембраны (Heggers J.P., Robson М.С., Manavalen K. et al. Experimental and clinical observations on frostbite. Ann Emerg Med. 1987; 16: 1056-1062). При медленном процессе замерзания, основная масса воды кристаллизуется внеклеточно, что приводит к процессу клеточной дегидратации. Это вызывает нарушение электролитного баланса, что в свою очередь также ведет к изменению белковых структур (Braker M.D. Environmental and thermal injury. Clin Sports Med. 1992; 11: 419-436). Клеточная дегидратация, микрососудистый тромбоз приводит к развитию ишемии тканей и некрозу. Исходом данных процессов является тяжелая травма, как правило заканчивающаяся инвалидностью (Weatherley-White R.C., Sjostrom В., and Paton, B.C. Experimental studies in cold injury (II. The pathogenesis of frostbite). J Surg Res. 1964; 4: 17-22; Sjostrom В., Weatherley-White R.C., and Paton B.C. Experimental studies in cold injury (I. The individual response to a standard cold environment). J Surg Res. 1964; 4: 12-16; Sjostrom В., Weatherley-White R.C., and Paton B.C. Experimental studies in cold injury (I. The individual response to a standard cold environment). J Surg Res. 1964; 4: 12-16).

Другим не менее значимым фактором, усугубляющим тяжесть криоповреждения является реперфузионный эффект, возникающий при восстановлении кровотока (Manson P.N., Jesudass R., Marzella L., Bulkley G.B., Im, M.J., and Narayan, K.N. Evidence for an early free radical-mediated reperfusion injury in frostbite. Free Rad Biol Med. 1991; 10: 7-11).

Также следует отметить, что уже на стадии общего переохлаждения происходит централизация кровообращения и, как следствие, к развитию ишемически-реперфузионного синдрома (ИРС), даже без стадии обморожения.

Патогенез ишемически-реперфузионного повреждения весьма сложен и включает в себя сочетание таких процессов, как воспаление, метаболический дисбаланс, оскидативный стресс и т.д.

Следует отметить, что в условиях Крайнего Севера лечение травм, ожогов и обморожений, сопровождающихся ИРС, вызванным общим переохлаждением в сочетании с развившимся полярно-гипоксическим синдромом, протекает более длительно и требует больших материальных затрат, связанных с пребыванием пациента в стационаре.

Следует отметить, что за исключением быстрого согревания пострадавшего, за последние 50 лет не было предложено эффективных методов терапии отморожения на догоспитальном периоде (Sjostrom В., Weatherley-White R.C., and Paton B.C. Experimental studies in cold injury (I. The individual response to a standard cold environment). J Surg Res. 1964; 4: 12-16).

Одним из препятствий на пути прогресса в данной области является отсутствие надежного доклинического метода скрининга терапевтических средств на животных, в частности отсутствие экспериментальной модели, позволяющей расширить понимание патофизиологических механизмов, лежащих в основе переохлаждения и обморожения в условиях Крайнего Севера.

Известен способ моделирования отморожения конечностей путем охлаждения конечности экспериментального животного в морозильной камере, где конечность животного обрабатывают депилятором, охлаждают бесконтактно при температуре -20 С и при длительности экспозиции 80 мин моделируют I степень отморожения, при экспозиции 120 мин - II степень, при экспозиции 180 мин и более - некроз конечности (SU 1599884, 15.10.1990 // Способ моделирования отморожения конечностей).

Известен также способ моделирования отморожений для отбора и оценки эффективности фармакологических средств при терапии отморожений заключающийся в контактном охлаждении одной из задних конечностей лабораторного животного угольной кислотой, в качестве лабораторных животных используют мышей, охлаждению подвергают подошвенную поверхность лапы, экспозицию осуществляют в течение 15-90 с (SU 1820405, 07.06.1993).

В настоящее время в работе Miao MS и соавт. (Miao MS, Xiang LL, Bai M, Cao LH. Frostbite animal model preparation specification (draft). Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2018 Jan; 43(2): 410-414. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20171027.010) показана модель развития обморожения у животного, где после эпиляции волосяного покрова криоповреждение мышам проводили путем опускания конечности в охлажденный до -20 С 95% раствор этанола на время от 1 до 15 минут в зависимости от вида животного (мышь, крыса, кролик) и необходимой степени повреждения.

Недостатком данного метода является:

1) Токсическое воздействие этанола на организм животного;

2) Сложность с точным дозированием площади поражения;

3) Температурное воздействие на весь организм животного.

Данные недостатки устранены в работе Auerbach LJ и соавт. (A novel mouse model for frostbite injury. Wilderness Environ Med. 2013 Jun; 24(2): 94-104. doi: 10.1016/j.wem.2012.11.020. Epub 2013 Mar 6), в которой мышей линии С57В1/6J в возрасте от 8 до 12 недель дэпилировали, обрабатывали изопропиловым спиртом и формировали круг диаметром 3 см. На коже фиксировали керамические (ферритовые) магниты (диаметр 0,5 дюйма, толщина 0,219 дюйма, вес 3,5 г), которые предварительно помещали на сухой лед (-78,5°С) и оставляли охлаждаться в течение 15 минут. Для нанесения криотравмы кожу мыши на спине оттягивали формировали кожную складку, которую помещали между двумя магнитами так, чтобы они прилипали с противоположных сторон кожной складки. Используя силиконовый барьер между магнитами и телом животного снижали тепловую конвекцию и защищали животное от общего переохлаждения. Наборы из 2 охлаждаемых магнитов оставляли на месте на 1 минуту, а затем заменяли на новые. Цикл замены магнита повторялся общей сложностью 5 раз. В результате чего время замораживания составило 5 минут.

Преимуществами данного метода являются:

1) Ограничение повреждения прилегающих к зоне повреждения тканей;

2) Дозированное по времени степень повреждения;

3) Снижение системной гипотермии;

4) Высокая выживаемость животных.

Однако, недостатком данной модели является невозможность моделирования общей гипоксии, возникающей в условиях Крайнего Севера.

Поэтому задачей данного изобретения является разработка экспериментальной модели отморожения кожных покровов в гипоксических условиях.

Нами была разработана модель отморожения кожных покровов в сочетании с нахождением животного в состоянии общей гипоксии.

Способ моделирования отморожения кожных покровов экспериментальных животных в гипоксических условиях заключается в контактной модели отморожения кожи с применением жидкого азота, где охлаждению жидким азотом подвергают депелированный участок кожи экспериментального животного в течение 1 минуты, циклом 2-5 раз, с дальнейшим помещением животного в гипоксические условия со сниженным содержанием кислорода до 15%.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка модели отморожения кожных покровов животного в гипоксических условиях, которая позволяет проводить скрининг терапевтических веществ на основе как гистологических изменений, так и скорости заживления раны. Данная модель отражает патофизиологические механизмы, лежащие в основе переохлаждения и отморожения тканей, сопровождающиеся ишемически-реперфузионными повреждениями в условиях гипоксии.

Краткое описание фигур.

Фиг. 1. ЖК-модуль.

Фиг. 2. Датчик кислорода EnergoM-3001-О₂

Фиг. 3. Картина кожи экспериментального животного через 1 сутки после моделирования.

Фиг. 4. Картина кожи экспериментального животного через 5 суток после моделирования.

Фиг. 5. Гистологическая картина кожи экспериментального животного через 1 сутки после моделирования (гематоксилин-эозин, увеличение 200).

Фиг. 6. Гистологическая картина кожи экспериментального животного через 5 сутки после моделирования (гематоксилин-эозин, увеличение 200).

Фиг. 7. Динамика закрытия раны у животных, находящихся в нормоксических условиях и гипоксических условиях при моделировании (21% и 15% O2, соответственно).

Подробное описание изобретения.

Содержание животных, оперативные вмешательства, а также выведение животных из опыта проведено в соответствии с этическими нормами, изложенными в Женевской конвенции (1961), а также в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики» (Минздрав СССР, №755 от 12.08.1977 г.).

Эксперименты проводились на мышах самцах линии BalbC массой 28-30 г. Под общим наркозом (Золетил) животным брили спину. Затем пальцами формировали на спине кожную складку, которую бережно фиксировали в двух сторон пластиковыми щипцами без нанесения кожной травмы. Расстояние между щипцами составило 2 см. Для нанесения травмы использовали металлический инструмент - плоскогубцы с гладкой поверхностью. Инструмент предварительно помещали в жидкий азот (-195,75 С) на 1 минуту. «Губками» инструмента захватывали участок кожи (площадью 0,5 см2). Инструмент фиксировали в течение 1 минуты. Цикл криодеструкции повторяли 5 раз, чтобы время повреждения составляло не более 5 минут.

Затем животных помещали в гипоксические условия. Камеры позволяют содержать животных в условиях со сниженным или повышенным содержанием кислорода. Контроллер способен изменять уровень O2 в диапазоне от 0 до 100% с шагом в 0,1%. Для работы необходимы источники (баллоны) азота. Содержание O2 в камере может контролироваться при помощи микропроцессорного контроллера O2.

Концентрация кислорода в камере составляла 15%. Уровень кислорода контролировался датчиком O2 фирмы EnergoM-3001-O₂ (фиг. 1, фиг. 2).

Животные содержались в камере в течение 2 часов.

В другом варианте изобретения бокс размещается в холодильнике при температуре +4 С.

В другом варианте изобретения концентрация кислорода в камере составляет 15-20%.

Результаты.

Для подтверждения эффективности предложенной модели были проведены эксперименты, в которых животным наносилась криодеструкция площадью 1 см2 (фиг. 3). В контрольной группе животные после травмы помещались в бокс с концентрацией кислорода 21%. Животные в опытной группе помещались в бокс с концентрацией кислорода 15% на 2 часа.

В ходе эксперимента ежедневно оценивали площадь эпителизации раны (фиг. 4). Материалы для гистологических исследований забирали на 1 и 5 сутки.

В ходе эксперимента было отмечено, что через сутки (фиг. 5) в поврежденных тканях отмечается некроз всех слоев дермы и подкожной клетчатки. Также было отмечено разрыхление коллагеновых волокон, что является косвенным свидетельством их разрушения кристаллами воды.

На 5 сутки (фиг. 6) отмечается обширные некрозы всех слоев дермы, нарушение эпителиального слоя, обширная лейкоцитарная инфильтрация, разрушение коллагеновых волокон, расширение просвета сосудов подкожной клетчатки.

В контрольной группе было отмечено, что полный процесс эпителизации заканчивается на 8 сутки. В опытной группе полная эпителизация была отмечена только на 11 сутки (фиг. 7).

Проведенные эксперименты подтвердили, что у животных с моделированием отморожения кожных покровов в сочетании с гипоксическими условиями, достоверно снижается скорость регенерации кожных покровов, процесс достоверно замедляется. Следовательно, при использовании данной модели отморожения кожи патологические процессы проходят также, как и в условиях гипоксии Крайнего Севера.

Таким образом, разработанная модель отморожения кожных покровов животного в гипоксических условиях позволит проводить скрининг терапевтических веществ на основе как гистологических изменений, так и скорости заживления раны.