Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии выделения, культивирования фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов.

Известен способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток - после раскалывания коронки извлекают пульпу с помощью пульсоэкстрактора; промывают ее раствором Хенкса с добавлением 0,5 г/л цефазолина; измельчают ткань ножницами; проводят ферментативную обработку, используя коллагеназу 1 типа (2 мг/мл) в течение 40 минут при 37°; полученную клеточную суспензию переносят в чашки Петри и культивируют в ростовой среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 2 mM L-глутамина, 100 мг/л амикацина, при стандартных культуральных условиях (37°, 5% СО₂) до образования 70% монослоя; среду меняют каждые 3 суток [1]. Недостатками способа являются: потеря клеток на этапе раскалывания коронки зуба и в результате механического измельчения пульпы; длительная ферментативная обработка тканей; отсутствие инактивации ферментов при отмывке, анализа качества выделенных клеток на жизнеспособность, расчета посевной дозы.

Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пульпы молочного зуба без разрушения коронки [2]. После отмывки зуба от крови и слизи проводят ферментативную обработку, заполняя внутренние полости зуба через апикальную часть его корневых каналов 0,1-0,4% коллагеназой при помощи шприца с иглой в течение 20-120 минут при температуре от 25° до 39°; получают содержимое внутренних полостей зуба несколькими способами: промывкой каналов сбалансированным солевым раствором, продувкой газом; собранную жидкость центрифугируют; удаляют надосадочную жидкость; полученный осадок ресуспендируют в питательной среде и переносят в культуральный флакон; культивируют при постоянной температуре 37°С и 5% СО₂. Данный способ взят за прототип.

Недостатками являются отсутствие анализа донорского материала на стерильность; при промывке каналов зуба с ферментативной обработкой 0,1-0,4% коллагеназой возможна потеря клеток; недостаточная инактивация ферментов при отмывке, высокая температура при центрифугировании снижают качество полученных клеток; отсутствует расчет посевной дозы; в процессе культивирования не используется кондиционированная среда, которая оказывает положительное влияние на пролиферацию клеток. Целью изобретения является создание способа получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов.

Эта цель достигается тем, что при появлении признаков выпадения молочного зуба у ребенка его родителям выдают стерильный пенициллиновый флакон с раствором Хенкса с антибиотиками, в который помещают выпавший зуб; после доставки флакона в лабораторию, зуб извлекают стерильным инструментом в чашку Петри и трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками; переносят зуб в новую пробирку со стерильным раствором Хенкса с антибиотиками и помещают ее в медицинский холодильник на 24 ч; в оставшийся в транспортировочном флаконе раствор добавляют три капли сыворотки плодов коровы и помещают его в термостат, инкубируя при 37° в течение 24 ч, после чего проводят контроль стерильности забора; при отсутствии признаков контаминации материала в инсулиновый шприц набирают 0,2 мл 0,1% коллагеназы из панкреаса краба ООО «БиолоТ»; иглу шприца вводят в канал молочного зуба и аспирируют содержимое канала в шприц; переносят содержимое в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение двух минут при комнатной температуре; инактивируют действие фермента, добавляя в пробирку 2 мл стерильного 0,02% раствора Версена и 1 мл 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином; центрифугируют пробирку в холодовой центрифуге при температуре 4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 5 мин; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде α-МЕМ с глютамином, включающей 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с полной питательной средой α-МЕМ с глютамином, включающей 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С, 5% CO₂ и постоянной влажности; через день добавляют во флакон 0,2 мл новую аналогичную питательную среду; первую смену среды проводят на 7 сутки; кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками отбирают пипеткой, центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре 4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 10 мин, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Помещение молочных зубов в стерильный флакон с раствором Хенкса и антибиотиками исключает контаминацию донорского материала в процессе транспортировки. Анализ стерильности забора молочного зуба позволяет оценить пригодность материала для получения качественной культуры клеток и сразу забраковать его при наличии признаков контаминации, что позволит избежать напрасный труд сотрудников и предотвратит перерасход материальных средств.

Забор материала из канала зуба инсулиновым шприцем с 0,1% раствором коллагеназы позволяет минимизировать потери клеток, когда как при промывке сбалансированным раствором или при продувке газом происходит их потеря. Ферментативная обработка материала 0,1% раствором коллагеназы из панкреаса краба в течение двух минут при комнатной температуре создает оптимальные условия для выхода клеток из тканей. Применение 0,02% раствора Версена и 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином инактивируют действие фермента, что наряду с Холодовым центрифугированием при температуре 4°С не оказывает повреждающего воздействия на клетки.

Подсчет клеток в камере Горяева проводят для того, чтобы рассчитать посевную дозу жизнеспособных клеток для внесения их в культуральный флакон. Кондиционированную среду при пересевах клеток во флакон добавляют к свежей потому, что она содержит физиологически активные продукты жизнедеятельности культивируемых в ней клеток и оказывает положительное влияние на пролиферацию клеток в процессе культивирования.

Способ осуществляется следующим образом. При появлении признаков выпадения молочного зуба у ребенка его родителям выдают стерильный пенициллиновый флакон с раствором Хенкса с антибиотиками, в который помещают выпавший зуб. После доставки флакона в лабораторию, зуб извлекают стерильным инструментом в чашку Петри и трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками. Переносят зуб в новую пробирку со стерильным раствором Хенкса с антибиотиками и помещают ее в медицинский холодильник на 24 часа. В оставшийся в транспортировочном флаконе раствор добавляют три капли сыворотки плодов коровы и помещают его в термостат, инкубируя при 37° в течение 24 часов, после чего проводят контроль стерильности забора.

При отсутствии признаков контаминации материала в инсулиновый шприц набирают 0,2 мл 0,1% коллагеназы из панкреаса краба ООО «БиолоТ». Иглу шприца вводят в канал молочного зуба и аспирируют содержимое канала в шприц. Переносят содержимое в центрифужную пробирку и инкубируют ее в течение двух минут при комнатной температуре. Инактивируют действие фермента, добавляя в пробирку 2 мл стерильного 0,02% раствора Версена и 1 мл 10% полной ростовой среды α-МЕМ с глютамином. Центрифугируют пробирку в холодовой центрифуге при температуре 4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость утилизируют. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде α-МЕМ с глютамином, включающей 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина.

Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего.

Высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с полной питательной средой - α-МЕМ с глютамином, включающей 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина.

Культивирование проводят в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С, 5% CO₂ и постоянной влажности. Через день добавляют во флакон 0,2 мл новую аналогичную питательную среду. Первую смену среды проводят на 7 сутки. Кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками отбирают пипеткой, центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре 4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 10 мин, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Способ иллюстрируется клиническим примером. У ребенка 6 лет появились признаки выпадения молочного зуба. Сотрудники лаборатории выдали родителям ребенка пенициллиновый флакон со стерильным раствором Хенкса с антибиотиками. Выпавший молочный зуб родители поместили во флакон, который был доставлен сотрудником в лабораторию. Выполнен анализ стерильности забора. Через 24 ч получен результат- материал стерильный. По разработанному способу выполнена обработка материала, выделение и культивирование фибробластоподобных клеток из пульпы молочного зуба. Клетки имели индекс адгезии (86,3±0,8% - 87,5±0,2%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,8±0,3-1,9), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 97,5, до 98,8%.

Характеристика полученных линий фибробластоподобных клеток приведена в Таблице 1. На фигуре 1 показано микрофото нативной культуры фибробластоподобных клеток, полученных из пульпы молочного зуба по разработанному способу. Использовали инвертированный микроскоп, фазовый контраст. Увеличение 100.

Клетки были использованы для создания клеточно-тканевых трансплантатов и для тестирования новых изделий медицинского назначения.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов может использоваться в специализированных лабораториях культур клеток для получения клеточных продуктов для регенераторной медицины, в исследовательских целях для тестирования in vitro.

Информационные источники

1. «Остеогенный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пульпы молочных зубов до и после криоконсервации» Т.Б. Бухарова, с соавт. Журнал «Гены и клетки» Том XI, №4, 2016 стр. 43-47.

2. Патент RU 2 679 082 С1 от 05.02. 2019 «Способ извлечения пульпы зуба для получения культуры стволовых клеток».

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пульпы молочных зубов