Результат интеллектуальной деятельности: Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.

Известно использование тест- системы при проведении ПНР в реальном времени для определения ДНК тканей животных в мясном продукте (CN 108624659A, кл C12G 1/6851, 2018 г.).

Также известен набор (патент CN 106435008, C12N 15/11, 2017 г.) содержащий специфичные для участка генома ДНК перепелов олигонуклеотидных праймеров и зондов. Однако известный набор используют для обнаружения полов перепелов (cotuenix coturnix).

Наиболее близким по технической сущности является техническое решение (патент РФ №2680094, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2019 г.) включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд,

взятых в объемном соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК ткани перепелки в кормах и пищевых продуктах, недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты, а также использование генома бактериофага Т4 с возможными повреждениями, после исследования, что также влияет на точность выявления объекта.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности идентификации видовой принадлежности ткани перепелки, упрощение процесса подготовки внутреннего контроля и уменьшение стоимости этого процесса.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для идентицикации ДНК ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд,

взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) со следующей нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации видовой принадлежности ткани птиц семейства дятловых с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-система для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах реализуется следующим образом.

Для исследования сухих кормов и мясных полуфабрикатов на содержание ДНК ткани перепелки проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для ДНК ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации ткани перепелки для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов ДНК ткани перепелки обыкновенной Coturnix coturnix) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага Т4 со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани перепелок в продуктах. Использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также улучшает качество процесса идентификации.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) были отобраны на основе последовательности гена b митохондри-альной ДНК генома (Coturnix coturnix mitochondrion cytochrome b gene, complete cds Sequence ID: L08377. 1Length: 1143)

Дизайн олигонуклеотидных праймеров разработан с использованием специализированного программного обеспечения Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). В результате анализа выбран участок между 800 и 1100 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности. С помощью программы «Oligo 6.0» рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома.

Специфичность праймеров (C.cot-F и C.cot-R) оценивали на сервере NCBI с использованием программы BLAST.

Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклео-тидный флуоресцентно-меченный зонд C.cot-Z (гомологичный участку нук-леотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров C.cot-F и C.cot-R). 3`-конец олигонуклеотидного зонда был помечен флуоресцентным красителем HEX, а 5`-конец зонда содержит гаситель флуоресценции BHQ1. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР в качестве праймеров и зонда. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 600 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олиго-нуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI.

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного использования тест-системы для идентификации ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в сухих кормах и мясных продуктах

Для подтверждения эффективности тест-системы были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.

От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.

Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.

Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-ПЕРЕПЕЛ-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы). Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ПЕРЕПЕЛ-ФАКТОР» для определения ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в РВ ТУ 21.10.60-163-51062356-2018, для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.

Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Исследования состоит из трех этапов:

• экстракция нуклеиновая кислота (НК);

• проведение реакции ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), вносят по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) для ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix), в качестве которого, используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл.

Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительного контрольного образца (ПКО) ПЕРЕПЕЛ, ВКО ПЕРЕПЕЛ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ ПЕРЕПЕЛ;

10 мкл ПЦР БУФЕР ПЕРЕПЕЛ;

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.

Интерпретация результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК - на канале JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К - на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на канале JOE/Yellow) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ. В образце обнаружена ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix), если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).

Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным. Образец считается отрицательным ДНК ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) не обнаружена), если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.

Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани перепелки представлен в таблице 5.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось, что чувствительность ПЦР при обнаружении примеси ткани перепелки обыкновенной (Coturnix coturnix) в кормах и в мясных фаршах примерно в 1,5 раза выше. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани перепелки в кормах и фаршах снизилась на 3-5%.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина».

<120> Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле

<140> 2019133079

< 160> 7

< 210> 1

< 211> 23

< 212> ДНК

< 213> LSDV

< 400> 1

cccattctaacacgcctaactcc 23

< 210> 2

< 211> 22

< 212> ДНК

< 213> LSDV

< 400> 2

ccactagaacacgacactgtac 22

< 210> 3

< 211> 24

< 212> ДНК

< 213> LSDV

< 400> 3

ctgtaatgaactaaccatattagc 24

< 210> 4

< 211> 23

< 212> ДНК

< 213> LSDV

< 400> 4

cctcgtcctaaagctgctacagc 23

< 210> 5

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 4

tacatataaatcacgcaaagc 21

< 210> 6

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 6

tagtatggctaatcttattgg 21

< 210> 7

< 211> 21

< 212> ДНК

< 213> Бактериофаг Т4

< 400> 7

acattggcactgaccgagttc 21

<---