Тест-система для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний а именно к средствам диагностики инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известен тест-система (патент РФ №2506317, C12Q 1/68, 2014 г), генома возбудителя инфекции у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинук-леозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для исследуемой инфекции, смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента TAQ - POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец.

Наиболее близким является тест - система для молекулярно-генетической идентификации Brucella spp. с помощью полимеразной цепной реакции (https://infopedia.su/15×72b0.html), включающий пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазми-ду, содержащую фрагмент гена возбудителя Brucella spp., синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями для молеку-лярно-генетической идентификации Brucella spp.

Однако в известном техническом решении используется тест-система для проведения ПНР в агарозном теле и последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза.

Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома возбудителя ДНК Brucella spp. инфекции у сельскохозяйственных животных.

Техническим результатом является получение достоверной диагностики возбудителя ДНК Brucella spp.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, внутренний контрольный образец, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена возбудителя Brucella spp, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды меченные красителями, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Brucella spp и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

В7 F TGAAGCTGCCTGCATCGGTC прямой праймер

B7R CATAATGGCCGGGTGTTGGCT обратный праймер

В7Р HEX -CAACAGCATGCAGCTTGGTCGTCAATC-BHQ1 зонд

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер

Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК Brucella spp. инфекции животных проводят реакцию в одной ПЦР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома Brucella spp. олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 Канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.), на фиг. 3 - таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (Brucella spp) и A. Green (ВКО).

Заявляемый тест-система рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики Brucella spp. инфекции у животных, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-система для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) у сельскохозяйственных животных сельскохозяйственных животных применяется следующим образом.

Предварительно сорбционным методом выделяют ДНК генома возбудителя Brucella spp. из биологического материала, который берут от инфицированных животных по выбору:

1. Цельная кровь, плазма крови, сыворотка крови. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Для получения сыворотки забирают кровь в пробирку без антикоагулянта;

2. Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду;

3. Содержимое брюшной полости и желудка, селезенка, печень абортированного плода;

4. Плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных;

5. Содержимое бурс, гигром;

6. Кусочки паренхиматозных органов (печень, селезенка);

7. Парные лимфатические узлы парааортальные, надвыменные, паховые, тазовые) отбирают целиком с обеих сторон;

8. Семенники с придатками от самцов с признаками орхита или эпидидимита. Культуры микроорганизмов:

- культуры в жидких средах, без предварительной подготовки;

- бактериальные колонии, ресуспендировать в 0,5 мл физиологического раствора.

Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Brucella spp и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

В7 F TGAAGCTGCCTGCATCGGTC прямой праймер

B7R CATAATGGCCGGGTGTTGGCT обратный праймер

В7Р HEX -CAACAGCATGCAGCTTGGTCGTCAATC-BHQ1 зонд

T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер

T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер

Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд

Далее накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX)/Yellow для специфического сигнала; FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Праймеры, специфичные для Brucella spp. были отобраны на основе митохондриальной последовательности ДНК генома Brucella (Brucella canis strain GB1 chromosome II, complete sequence, CP027642.1, участок между 251426 и 251535). Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд В7Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров В7 F и B7R). Зонд был помечен красителем HEX. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

В качестве внутреннего контрольного образца использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного применения тест-системы для выявления генома возбудителя бруцеллезной инфекции Brucella spp.у с. -х животных.

Пробы цельной крови, консервированной ЭДТА, синовиальной жидкости, пунктаты из лимфоузлов, содержимое бурс и гигром, культуры микроорганизмов используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.

Для получения сыворотки пробирки с кровью (без антикоагулянта) отстаивают при комнатной температуре в течение 30 минут до полного образования сгустка. Затем центрифугируют при 600-1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 10 минут при комнатной температуре. Сыворотку переносят отдельными наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Для получения плазмы пробирку с цельной кровью центрифугируют в течение 10 мин при 1000 g (если кровь стояла при температуре от 2°С до 8°С более 1 ч после ее взятия, то пробирку следует аккуратно несколько раз перевернуть для равномерного перемешивания крови). Переносят плазму в количестве не менее 1 мл одноразовыми наконечниками с фильтром в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Пробы паренхиматозных органов, семенников, плодовых оболочек, плаценты размером 1 см³, лимфатические узлы целиком, гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 600-1600 g (3000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Молоко в объеме до 10 мл обеззараживают и центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.

Для анализа используют набор реагентов «ПЦР-БРУЦЕЛЛЕЗ-ФАКТОР», которые используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-БРУЦЕЛЛЕЗ-ФАКТОР» для выявления ДНК вируса (Brucella spp.) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ 21.10.60-103-51062356-2015 (http://www.vetfaktor.ru/.).

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).

Набор выпускается в двух вариантах:

1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы);

2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Составы наборов приведены в таблицах 1 и 2.

Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:

экстракция нуклеитидных кислот (НК);

проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

учет результатов анализа.

Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое -количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) Brucella spp. в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначают как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С. Подготавливают образцы к проведению ПЦР следующим образом. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы -10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют, используя положительный контрольный образец (ПКО) Brucella spp., ВКО Brucella spp. и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Brucella spp. и фрагмент генома бактериофага Т4 в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР смесь Brucella spp.

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР Brucella spp.

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО Brucella spp.

Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor Gene»

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя. Далее проводят интерпретацию результатов анализа.

Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фиг. 1, 3). В четырех пробах, включая клинический образец k88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фиг. 2, 3).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4, фигурами 1, 2, 3.

Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого технического решения с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при выявлении генома возбудителя бруцеллезной инфекции (Brucella spp.) на 3,0-3,3% выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.