Способ выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Известен способ определения бактерий семейства Chlamydiaceae, (патент РФ 2486255, кл. C12Q 1/68, 2013 г. ), включающий амплификацию бактериальной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале путем проведения полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров с последовательностями, не менее чем на 75% гомологичными последовательностям SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, и зонда с последовательностью, не менее чем на 75% гомологичной последовательности SEQ ID NO:3, содержащего на 5' и/или 3' концах метки, где в качестве меток зонда выступают флуоресцентные красители.

Также известен способ выявления хламидий в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени (патент РФ №2241042, C12Q 1/68, 2004 г. - прототип), включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением последовательно 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Общим недостатком известных технических решений является не достаточная чувствительность и специфичность, что влияет на степень достоверности диагностики выявления генома возбудителя ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и отсутствие возможности выявление хламидий у птиц.

Техническим результатом является повышение точности диагностики наличия возбудителя ДНК хламидий и расширение функциональных возможностей.

Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК хламидий у сельскохозяйственных животных и птиц включающем выделение ДНК хламидий Chlamydia spp. из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя хламидий Chlamydia spp олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала и сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, согласно изобретению дополнительно отбирают биологический материал от инфицированных птиц, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя ДНК хламидий и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

при этом накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX) /Yellow для специфического сигнала ДНК хламидий Chlamydia spp; FAM/Green - для сигнала внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики возбудителя ДНК хламидий (Chlamydiaceae) инфекции животных проводят реакцию в одной ПНР-пробирке (one-tube) с использованием специфичных для участка генома Chlamydiaceae олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, так как относится к средствам диагностики Chlamydiaceae инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 Канал HEX - для тестирования наличия ДНК Chlamydiaceae, фиг. 3 - таблица количественных данные для Cycling A.Green (ВКО) и для Cycling A.Yellow (ДНК Chlamydiaceae).

Способ выявления ДНК хламидий (Chlamydiaceae) у сельскохозяйственных животных и птиц осуществляется следующим образом. Предварительно выделяют ДНК генома возбудителя хламидий (Chlamydiaceae) из биологического материала, взятый от инфицированных животных и птиц по выбору: мазки со слизистых, фрагменты тканей и органов, сперма, моча сорбционным методом. Затем проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с добавлением внутреннего положительного контроля, в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов и проводят 45 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК хламидий (Chlamydiaceae) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

Далее по накоплению флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: JOE(HEX) /Yellow для специфического сигнала; FAM/Green для сигнала внутреннего контроля, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.

Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Выбранные праймеры позволяют тестировать все значимые для ветеринарии хламидий Chlamydia suis Chlamydia abortus Chlamydia psittaci Chlamydia felis Chlamydia pecorum Chlamydia avium Chlamydia muridarum Chlamydia sp. Chlamydia gallinacean референс последовательность Chlamydophila abortus strain EBA 16S and 23S ribosomal RNA operon, complete sequence Sequence ID: U76710.2 Length: 4854 на этой последовательности в зоне с 2250 по 2450 выбран консервативный фрагмент для хламидий размер ампликона составляет 125 пар нуклеотидов

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащийуникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Fam. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК хламидий (Chlamydiaceae) инфекции у с.-х животных и птиц.

Для исследования используют от инфицированных животных хламидий (Chlamydiaceae) по выбору следующий материал:

• Мазки и соскобы слизистых оболочек (ротоглотки, конъюнктивы, урогенитального тракта, прямой кишки, у птиц - клоаки). Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;

- фрагменты тканей и паренхиматозных органов павших или вынужденно убитых животных и птиц (миндалины, селезенка, легкие, печень, кусочки плодовых оболочек, аборт-плоды). Отбирают в стерильный контейнер;

- сперму, отбирают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл;

- мочу отбирают в количестве 10-20 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер;

- помет птиц, массой не менее 0,5 г, в сухой стерильный контейнер.

Затем проводят подготовку проб. Соскобы со слизистых конъюнктивы и ротоглотки в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.

Сперму в объеме 0,5 мл разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11-12 тыс. об/мин в течение 10 мин, осадок, ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора, используют для экстракции ДНК.

Мочу в объеме 10 мл центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10-15 мин. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 мл материала и повторяют центрифугирование. Надосадочную жидкость осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 100 мкл его используют для экстракции ДНК. До получения осадка мочу нельзя охлаждать или замораживать.

Исследуемые пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавляют пятикратный объем стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера и тщательно перемешивают. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и отстаивают в течение 5-7 мин после чего откручивают на миницентрифуге при 1,5-2,0 тыс. об/мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции ДНК.

Из помета птиц готовят 10% суспензию в физиологическом растворе, центрифугируют при 1,5 тыс. об/мин в течение 5 мин, 100 мкл надосадочной жидкости используют для экстракции ДНК. Далее осуществляют анализ, состоящий из трех этапов:

экстракция нуклеитидных кислот (НК);

проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

учет результатов анализа.

Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое-количество одноразовых пробирок объемом - 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) хламидий (Chlamydiaceae) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.

Проводят одноэтапную ПЦР РВ в одной пробирке. Для проведения ПЦР используют наборы позволяющие специфически амплифицировать фрагмент генома Chlamydiaceae и ДНК внутреннего положительного контроля (бактериофага Т4) в мультиплексной полимеразной цепной реакции. Детекция продуктов амплификации осуществляется в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Для проведения анализа используют наборы, которые состоят из комплектов реагентов для проведения ПНР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Составы наборов приведены в таблицах 1 и 2.

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению «ПЦР-ХЛАМИДИЯ-ФАКТОР», набора реагентов для выявления ДНК хламидий в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

ТУ 21.10.60-108-51062356-2016. http://www.vetfaktor.ru/.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо ис-следуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначают как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С. Подготавливают образцы к проведению ПЦР следующим образом. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы -10 мкл. Успешное прохождение реакции контролируют используя положительный контрольный образец (ПКО) Chlamydiaceae, ВКО Chlamydiaceae и ДНК БУФЕР, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома ДНК Chlamydiaceae и фрагмент генома бактериофага Т4 в соотношении 1:1, взятых по 5000 копий специфического фрагмента в 10 мкл (в соотношении 1:1).

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР смесь Chlamydiaceae

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР Chlamydiaceae

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Затем перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) - 10 мкл ПКО Chlm. Проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.

Для проведения амплификации был использован прибор «Rotor-Gene Q»

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Программируют прибор согласно инструкции производителя.

Далее проводят интерпретацию результатов анализа. Во всех пробах за исключением пробы - отрицательный образец - (К-) наблюдается кривая роста флуоресценции (фиг. 1, 3). В четырех пробах, включая клинический образец k88_3668 и положительный контрольный образец (+) в двух повторах, наблюдается кривая роста флуоресценции. В пробирке - отрицательный образец - (К-) - кривая роста флуоресценции отсутствует (фиг. 2, 3).

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4, фиг. 1, 2.

Образец считается положительным (ДНК возбудителя (Chlamydiaceae) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.

В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя (Chlamydiaceae) отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналу FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, фиг. 1, 2).

Для оценки чувствительности ПЦР РВ проводили постановку реакции с использованием в качестве матрицы титрованного препарата транкрипта, полученного на рекомбинантной плазмиде, содержащей ограниченный праймерами ChlmF и ChlmR фрагмент генома возбудителя (Chlamydiaceae). Чувствительность системы составила 10⁵ г-экв/мл.