Способ определения родственных примесей в 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия с методом капиллярного электрофореза

Изобретение относится к аналитической и фармацевтической отрасли, а именно к определению родственных примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме (таблетки) 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия [RU 2624729]. Предлагаемый способ может быть применен в испытательных лабораториях контроля качества лекарственных средств, лабораториях ОКК фармацевтических предприятий, а также в научно-исследовательских лабораториях.

Известен способ определения примесей в 4,4'-(пропандиамидо)дибензоате натрия методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий растворение навески субстанции в 50% растворе метанола с последующим анализом полученного раствора на октадецилсилильном сорбенте, в качестве подвижной фазы применяют смесь метанола с 0,02% раствором фосфорной кислоты рН 2,7 в режиме градиентного элюирования (линейное изменение состава подвижной фазы: от 30% до 80% метанола в течение 20 минут), с использованием УФ-детектирования на 270 нм, приведенная длина волны соответствует максимуму поглощения всех аналитов. В качестве раствора сравнения используют раствор 4-аминобензойной кислоты (ПАБК) в предельно допустимой концентрации [Государственный контракт от «28» апреля 2017 г. №2017-14-N08-0005 УДК 615.45 № госрегистрации AAAA-A17-117062710026-7 Инв. №11-10.5/1 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, обладающего антистеатозным действием» шифр темы «2017-14-N08-0005»]. Способ пригоден для идентификации и количественного определения примесей 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия.

Недостатком способа является то, что 4,4'-(пропандиамидо)дибензоат натрия представляет собой соль, кислотная форма которой практически нерастворима в подвижной фазе, а в методике используется подвижная фаза с критически низким значением рН, т.е. существует опасность искажения результатов анализа за счет осаждения аналита непосредственно в хроматографической колонке. Кроме того, использование метода ВЭЖХ требует присутствия ядовитого и дорогостоящего растворителя (метанол).

Задачей изобретения является разработка свободного от использования метанола способа определения родственных примесей 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, а именно, ПАБК и 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты, получение достоверных данных при сниженных временных и экономических затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом предполагаемого изобретения является способ определения родственных примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме (таблетки) 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия путем использования метода капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

Технический результат достигается тем, что осуществляют капиллярный зонный электрофорез, включающий подготовку раствора сравнения - раствора родственных примесей: 4-аминобензойной кислоты и 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты, и испытуемых растворов - субстанции и таблеток 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия, введение пробы в систему капиллярного электрофореза (гидродинамический ввод пробы, 210 мбар×с), проведение электрофоретического разделения с боратным буфером в качестве ведущего электролита (раствор натрия тетраборнокислого 10-водного концентрацией 50 ммоль/л, колонка кварцевая, общая длина колонки 60 см, эффективная длина колонки 50 см, внутренний диаметр 75 мкм, прилагаемое напряжение +20 кВ), спектрофотометрическое детектирование пиков при длине волны 270 нм и обработку результатов анализа.

Получены узкие пики с эффективностью более 5х10⁵ ТТ/м и разрешением более 2,5. Предел количественного определения по двум идентифицированным примесям (ПАБК и 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты) составил 0,1 мкг/мл, допустимое содержанием примесей 0,1%.

Полученные результаты проиллюстрированы.

Фиг. 1. Электрофореграмма родственных примесей 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия: ПАБК и 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты (раствора сравнения).

Фиг. 2. Электрофореграмма фармацевтической субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия (испытуемого раствора - ИР 1).

Фиг. 3. Электрофореграмма таблеток 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия (испытуемого раствора - ИР 2).

Способ определения родственных примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия (таблетки) методом КЗЭ осуществляют согласно методике, описанной ниже.

Пример 1. Подготовка вспомогательных растворов.

Исходный раствор ПАБК: 10,0 мг стандартного образца ПАБК помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, прибавляют 5 мл дистиллированной воды, выдерживают в ультразвуковой бане 5 мин, доводят до метки тем же растворителем, перемешивают.

Исходный раствор 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты: 10,0 мг стандартного образца 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, прибавляют 5 мл спирта, выдерживают в ультразвуковой бане 5 мин, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.

Раствор сравнения (раствор с предельно допустимым содержанием примесей): 100 мкл исходного раствора ПАБК и 100 мкл исходного раствора 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и перемешивают (концентрация обоих компонентов составляет 10 мкг/мл). 0,2 Мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют 10 мкл ацетона (в качестве маркера электроосмотического потока - ЭОП), доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и перемешивают (концентрация обоих компонентов составляет 0,2 мкг/мл). Раствор тщательно перемешивают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут.

Характеристики электрофореграммы раствора сравнения (фиг. 1) приведены в табл. 1, где:

ЭОП - маркер электроосмотического потока;

ШПВ - ширина пика на половине высоты;

ТТ - теоретическая тарелка;

As (0,1) - фактор асимметрии, рассчитанный на 10% высоты пика;

Rn, n+1 - разрешение;

ЭФП - истинная электрофоретическая подвижность.

Раствор для определения предела количественного определения (LOQ): раствор LOQ готовят двукратным разбавлением раствора сравнения с концентрацией 0,20 мг/мл (концентрация обоих компонентов составляет 0,1 мкг/мл).

Пример 2. Подготовка испытуемых растворов:

Испытуемый раствор ИР-1 - фармацевтической субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия: 10,0 мг субстанции 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, прибавляют 5 мл дистиллированной воды, выдерживают в ультразвуковой бане 5 мин, доводят до метки тем же растворителем, перемешивают (концентрация 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия составляет 1 мг/мл). 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют 10 мкл ацетона, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и перемешивают (концентрация 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия составляет 0,2 мкг/мл - ИР 1). Раствор тщательно перемешивают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут.

Характеристики электрофореграммы испытуемого раствора фармацевтической субстанции (фиг. 2) приведены в табл. 2.

Испытуемый раствор ИР-2 - извлечение из таблеток 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия дозировкой 60 мг: из порошка 20 растертых таблеток берут навеску 50,0 мг, помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, прибавляют 5 мл дистиллированной воды, выдерживают в ультразвуковой ванне 5 мин, доводят до метки тем же растворителем, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (концентрация 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия составляет 1 мг/мл). 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют 10 мкл ацетона, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и перемешивают (концентрация 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия составляет 0,2 мкг/мл - ИР 2). Раствор тщательно перемешивают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут.

Срок годности растворов 72 часа при температуре 25°С.

Характеристики электрофореграммы испытуемого раствора таблеток (фиг. 3) приведены в табл. 3.

Анализируют раствор сравнения, получая не менее 5 электрофореграмм в заданных условиях. Время миграции пика ПАБК около 6,9 мин (при этом истинная электрофоретическая подвижность (ЭФП) составляет -0,25 см²×кВ^-1×с^-1), 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты - около 5,6 мин (при этом истинная электрофоретическая подвижность составляет -0,18 см²×кВ^-1×с^-1).

Электрофоретическая система считается пригодной, если:

- отношение сигнал/шум на электрофореграмме раствора для определения предела количественного определения (LOQ) не менее 10;

- на электрофореграммах раствора сравнения относительные стандартные отклонения электрофоретических подвижностей и площадей пиков обоих компонентов, рассчитанные по 5 последовательным электрофореграммам, не более 5,0%.

Анализируют испытуемые растворы в заданных условиях, получая не менее 3 электрофореграмм.

Содержание примесей оценивают сравнением площадей пиков примесей в испытуемом растворе со средними значениями площадей пиков ПАБК и 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты в растворе сравнения.

Способ применим также при контроле качества лекарственных средств как способ определения допустимого содержания примесей, при этом:

- площадь пика ПАБК и неидентифицированной примеси с электрофоретической подвижностью -0,36 см²×кВ^-1×с^-1 в испытуемом растворе не должна превышать среднего значения площади ПАБК в растворе сравнения;

- площади пиков 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты и других единичных неидентифицированных примесей не должны превышать среднего значения площади 4-(3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойной кислоты в растворе сравнения.

Анализ метрологических характеристик и проведение валидационных испытаний способа определения примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия показывает высокую прецизионность полученных результатов. Использование дистиллированной воды в качестве растворителя и боратного буфера в качестве ведущего электролита приводит к снижению общей стоимости анализа. Способ не сопряжен с использованием метанола.

Предлагаемый способ определения родственных примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия с использованием метода КЗЭ со спектрофотометрическим детектированием апробирован на кафедре аналитической химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Предлагаемый способ определения родственных примесей в фармацевтической субстанции и готовой лекарственной форме 4,4'-(пропандиамидо)дибензоата натрия с использованием метода КЗЭ со спектрофотометрическим детектированием может быть рекомендован к применению в испытательных лабораториях контроля качества лекарственных средств, лабораториях ОКК фармацевтических предприятий, а также в научно-исследовательских лабораториях.