Нейрореабилитационное средство на основе 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия

Изобретение относится к медицине и фармации и касается нового нейрореабилитационного средства 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия формулы I, которое может быть использовано в медицине в качестве потенциального средства для восстановления после черепно-мозговых травм.

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является одной из ведущих причин смертности и стойкой утраты нетрудоспособности населения, как в РФ, так и за рубежом. Последствиями травматического повреждения мозга являются двигательные нарушения, ухудшение запоминания/потеря памяти, аффективные расстройства, стойкая утрата умственной и физической работоспособности, эпилепсия и другие нарушения. Несмотря на большое количество нейропротекторных/нейрореабилитационных средств, их применение не всегда обеспечивает достаточный клинический эффект.

Начиная с 70-х годов прошлого столетия, агонисты альфа-2 адренорецепторов используются в основном как антигипертензивные средства. Кроме того, у данной фармакологической группы наблюдаются седативные, анальгетические и противотревожные свойства. Позже, многие исследования показали, что в условиях эксперимента агонисты альфа-2 адренорецепторов способны улучшать гистоморфологическую картину головного мозга у животных после инсульта при введении до или во время ишемии [Zhang Y. Clonidine preconditioning decreases infarct size and improves neurological outcome from transient forebrain ischaemia in the rat // Neuroscience. 2004; 125(3): 625-31].

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала нейропротекторных/нейрореабилитационных средств, механизм действия которых реализуется через адренергические системы головного мозга, имеющих низкую токсичность.

Указанная задача достигается созданием нейрореабилитационного средства, разработанного на основе 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия.

Изобретение иллюстрируется примерами синтеза и исследования фармакологических свойств, описание включает четыре таблицы и сопровождается диаграммой (фиг.).

Фиг. - Влияние исследуемых лекарственных средств на объем повреждения головного мозга после ЧМТ у крыс.

Пример 1. Получение 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия (I).

Синтез осуществляется путем взаимодействия 1,3-дифенилгуанидина (II) с малоновым эфиром (III) без растворителя или в среде высококипящего апротонного растворителя при температуре 145-155°С с последующим получением натриевой соли по схеме:

Способ получения 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия (I) изучен и проведен в лабораторных условиях на стандартном товарном сырье.

Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом. Брутто-формула: C₁₆H₁₂N₃NaO₂. Найдено, %: С - 63.62, Н - 3.94, N - 13.99. Вычислено %: С - 63.79, Н - 4.01, N - 13.95.

Строение синтезированного вещества было доказано методами спектроскопии ЯМР ¹Н и ¹³С.

Пример 2. Определение острой токсичности

В опытах на 70 мышах и 42 крысах самцах при подкожном и внутримышечном введении заявляемого средства в возрастающих дозах (от 50 до 5000 мг/кг) не удалось определить ЛД50. Введение больших доз считается нецелесообразным. Доза 5000 мг/кг вызывала угнетение ЦНС (потеря двигательной активности). Таким образом, заявляемое средство можно отнести к малотоксичным веществам по различным классификациям (Hodge и Sterner:Toxicity classes. In:Canadian center for occupational Health and safety, 2005; Березовская И.В.: Химико-фармацевтический журнал, 2003; Гигиена и токсикология пестицидов и клиника отравлений, 1968).

Пример 3. Влияние Заявляемого средства на поведение крыс с ЧМТ в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ).

Все эксперименты проводили в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Минздрава РФ от 01.04.16 г. №199н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Крыс содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе, со свободным доступом к воде. Все опытные и контрольные животные были взяты из одного привоза и прошли карантин в течение 14 суток.

Исследования выполнены на белых беспородных крысах самцах весом 250-300 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). В группе контрольных животных было 20 крыс, по 10 - в опытных группах и 15 - в группе интактных. Все манипуляции, проводимые на крысах, были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии СПХФА.

Черепно-мозговую травму у крыс моделировали в соответствии с описанной ранее методикой [Isaev, N.K. Mitochondria-targeted plastoquinone antioxidant skqrl decreases trauma-induced neurological deficit in rat / N.K. Isaev, S.V. Novikova, E.V. Stelmashook et al. // Biochemistry. - 2012. - Vol. 77(9). P. 996-999]. У наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг) животных проводили трепанацию черепа в левой лобной части над зоной сенсомоторной коры. Далее по открытой твердой мозговой оболочке наносился дозируемый удар, высверленную пластину возвращали на место, зашивали разрез кожи.

Поведенческие и функциональные тесты у экспериментальных животных проводили на 1-е, 3-й и 7-е сутки.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Statistica 6.0».

На третьи сутки после травмы у крыс оценивали общую двигательную (ОДА) и поисково-исследовательскую активность (ПИА) в тесте «Открытое поле». ОДА рассчитывалась как сумма пересечений квадратов, стоек, заглядываний в норки и грумингов, а ПИА - как сумма стоек и заглядываний. Длительность тестирования составляла 3 минуты.

В тесте ПКЛ у крыс оценивали время нахождения в открытых (ОР) и закрытых рукавах (ЗР), а также ОДА, складывающуюся из количества заходов в темные/светлые рукава, стоек, выглядываний из темных рукавов, свисаний и грумингов.

В тесте «Открытое поле» заявляемое средство, вводимое в дозе 2,5 мг/кг, статистически значимо увеличивало показатели ОДА в 4,2 и ПИА в 2,7 раза по сравнению с контрольной группой. Важно отметить, что при введении данного средства в дозе 5 мг/кг, положительный эффект не наблюдался. Клонидин достоверно увеличивал ОДА в 3,5 раза по сравнению с контролем, однако статистически значимого улучшения показателя ПИА получено не было (табл. 1).

Примечание: * - достоверное отличие (р<0,05) по сравнению с контролем

В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» ни клонидин, ни заявляемое средство в дозе 2,5 мг/кг не приводили к изменению времени нахождения крыс в открытых и закрытых рукавах. ОДА животных данных групп также не отличалась от контроля. Время нахождения животных в центре лабиринта, в целом, не отличалось между группами, однако некоторое увеличение наблюдалось у группы клонидина. Заявляемое средство, вводимое травмированным крысам в дозе 5 мг/кг, достоверно увеличивало их время нахождения в закрытых рукавах (в 1,1 раза) по сравнению с контрольными животными, при этом время нахождения в открытых рукавах и ОДА статистически значимо снижались (табл. 2).

Примечание: * - достоверное отличие (р<0,05) по сравнению с контролем

Пример 4. Влияние Заявляемого средства на функцию передних и задних лап крыс с ЧМТ в тестах «Стимулирование конечностей» и «Сужающаяся дорожка».

На 1-е, 3-й и 7-е сутки после травмы у животных оценивали выраженность неврологического дефицита в тесте «Стимулирование конечностей», также известном как «Постановка конечности на опору», или, встречающемся в англоязычной литературе, «Limb placing test». Тест заключался в ответе конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию. В ходе тестирования оценивали состояние двигательной функции передней и задней лап в 7 различных испытаниях, результаты выражали в сумме баллов. Для оценки нарушений в работе конечностей использовалась следующая система подсчета: 2 балла - крыса полностью выполняла испытание; 1 балл - крыса выполняла испытание с задержкой в более чем 2 сек и/или не полностью; 0 баллов - крыса не отвечала на стимулирование конечности. Максимально возможное суммарное количество баллов было равно 14 [Silachev, D.N. Comparative evaluation of two methods for studies of experimental focal ischemia: magnetic resonance tomography and triphenyltetrazoleum detection of brain injuries / D.N. Silachev, D.B. Zorov, N.K. Isaev et. al. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009 - Vol. 147(2). - P. 269-272].

На седьмые сутки проводили тесты «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Стимулирование конечностей» и «Сужающаяся дорожка».

В тесте «Сужающаяся дорожка» оценивали сенсомоторную функцию передних и задних конечностей. Установка представляет собой две сужающиеся дорожки длиной 165 см, расположенные друг под другом, причем нижняя имеет бортики для расположения конечностей животного во время соскальзывания с верхней доски. В конце установки располагается черная коробка, являющаяся конечной целью перемещения животного. Точка старта освещается ярким светом, мотивируя крыс бежать к концу доски в черную коробку. Перед моделированием черепно-мозговой травмы животных в течение 3 дней приучали пересекать «сужающуюся дорожку». Во время тестирования движения крыс записывались на видеокамеру. В покадровом режиме просмотра видео для каждой конечности отдельно подсчитывали количество постановок конечности на нижнюю доску (ошибок), количество соскальзываний с верхней доски на нижнюю, а также общее количество шагов. Полученные по трем попыткам данные усреднялись, степень выраженности сенсомоторного дефицита рассчитывалась по формуле в процентах:

Ошибки + 0,5 × Соскальзывания / Общее кол-во шагов × 100.

Все испытуемые лекарственные средства (за исключением пирацетама) на 7-е сутки давали достоверное улучшение функции передних и задних лап в тесте «Стимулирование конечностей». В то же время достоверных различий между активностью испытуемых лекарственных средств получено не было. В тесте «Стимулирование конечностей» и клонидин, и заявляемое средство улучшали состояние двигательной функции передних и задних конечностей. Достоверных различий между результатами двух доз заявляемого средства получено не было (табл. 3).

Примечание: * - достоверное отличие (р<0,05) по сравнению с контролем

В тесте «Сужающаяся дорожка» наилучшие результаты показали крысы, которым вводили заявляемое средство в дозе 2,5 мг/кг. Введение заявляемого средства приводило к улучшению двигательной функции передних и задних лап в 2,3 и 1,9 раз соответственно по сравнению с контрольной группой. Холина альфосцерат не давал улучшений моторной функции травмированных животных в данном тесте, цитиколин приводил к улучшению функции только передней конечности (табл. 4).

Таблица 4

Примечание: * - достоверное отличие (р<0,05) по сравнению с контролем.

Таким образом, на модели черепно-мозговой травмы у крыс 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олят натрия в дозе 2,5 мг/кг уменьшает выраженность неврологического дефицита в тестах «Стимулирование конечностей», «Открытое поле» и «Сужающаяся дорожка».

Наиболее эффективной дозой заявляемого средства является 2,5 мг/кг.

Морфометрический анализ показал, что на 7-е сутки после недельного введения исследуемого вещества I в дозе 2,5 мг/кг крысам, перенесшим ЧМТ, у данных животных объем повреждения головного мозга в 1,6 раза меньше по сравнению с контрольной группой. Введение же клонидина в течение недели не приводило к статистически значимому увеличению выживаемости нервных клеток (фиг.).

Таким образом, доказано наличие нейрореабилитационной активности у 6-оксо-1-фенил-2-(фениламино)-1,6-дигидропиримидин-4-олята натрия (I) в дозах 2,5 мг/кг и 5 мг/кг на модели черепно-мозговой травмы у крыс и установлено его положительное влияние на поведение и двигательную функцию травмированных животных, а также уменьшение объема повреждения нервной ткани. По фармакологической активности исследуемое вещество превосходило препарат сравнения - клонидин.

Областью применения заявляемого средства может быть восстановительная неврология, более того, новое соединение имеет выраженную нейрореабилитационную активность, в большей степени, чем у ближайшего аналога - клонидина.