×
27.12.2019
219.017.f28c

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного. Для этого проводят забор пуповины у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи. Удаляют кровеносные сосуды. Оставшуюся ткань измельчают, переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1 и центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге в течение 20 минут. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде и подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток. Высевают клетки в культуральный флакон. Культивирование проводят в СО-инкубаторе и смену среды проводят каждые 5 суток культивирования. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. Изобретение позволяет получать фибробластоподобные клетки без риска контаминации условно-патогенной флорой. 1 табл.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии выделения, культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины.

Известен способ получения фибробластов из пуповины новорожденного, полученной при нормальных родах женщин на 39-40 недели гестации [1]. Недостатками способа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс по получению суспензии клеток из донорского материала.

Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного, полученного при нормальных родах на 39-40 недели гестации [2]. После отмывки донорского материала от крови и слизи, разрезают пупочный канатик ручным способом на фрагменты, повторно промывают их раствором Хенкса, измельчают фрагменты гомогенизатором до однородной массы; проводят ферментативную обработку, используя 0,075% коллагеназу I типа и коллагеназу IV типа (соотношение концентраций ферментов 1:1 в объемной пропорции 1:5) в течение 8-10 часов при 37° и периодически помешивая содержимое пробирок; пропускают в новую центрифужную пробирку полученный субстрат через двойное сито для клеток; центрифугируют в течение 8 минут при 1000 об./мин; получают осадок фибробластоподобных клеток, который ресуспендируют в культуральной среде с добавлением основного фактора роста фибробластов; подсчитывают общее количество полученных клеток в камере Горяева, вносят клетки в чашки Петри в посевной дозе 8-15×103/см2; при достижении 70-80% конфлюентности монослоя, клетки пересевают, культивируют до 4-6 пассажа, при этом клетки сохраняют свой диплоидный кариотип и высокую пролиферативную активность. Данный способ взят за прототип.

Недостатками прототипа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс получения суспензии клеток с использованием ручного труда; применение в процессе обработки пупочного канатика ферментов нескольких типов; недостаточная инактивация ферментов при отмывке; расчет посевной дозы, исходя от общего числа полученных клеток, а не от жизнеспособных.

Целью изобретения является создание способа получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного.

Эта цель достигается тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения, пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×105 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в CO2-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО2 и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Забор пуповины у обследованных женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения проводят для того, чтобы исключить контаминацию донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях. Лабораторный миксер применяют в процессе измельчения донорского материала для того, чтобы исключить трудоемкий ручной процесс по измельчению пуповины. 0,2% коллагеназу из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» применяют в процессе ферментативной обработки пуповины потому, что она обладает высокой коллагенолитической активностью (до 750 ЕД/мг по Мандлу) и не уступает по своему действию нескольким ферментам.

Термошейкер в процессе ферментативной обработки тканей применяют для того, чтобы она проходила при постоянном равномерном перемешивании среды и лучшем взаимодействии тканей с коллагеназой, создавая при этом оптимальные условия для выхода клеток. Кроме того, использование термошейкера исключает ручной труд по перемешиванию среды. Холодовое центрифугирование позволяет поддержтвать заданную температуру и не оказывает повреждающего воздействия на клетки. Подсчет полученных клеток в камере Горяева проводят для того, чтобы рассчитать посевную дозу жизнеспособных клеток для внесения их в культуральный флакон.

Кондиционированную среду используют при пересевах в процессе культивирования добавляя ее к свежей потому, что она содержит физиологически активные продукты жизнедеятельности культивируемых в ней клеток, данная среда оптимизирует процессы пролиферации клеток на ранних этапах культивирования, обеспечивает накопление клеток в необходимом количестве.

Способ осуществляется следующим образом. Забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают на фрагменты при помощи лабораторного миксера. Измельченную ткань переносят в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость утилизируют. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего. Высевают клетки в дозе 1×105 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Культивирование проводят в СО2-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО2 и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой. Эту среду центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую аналогичную среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Способ иллюстрируется клиническим примером. У здоровых женщин после рождения детей путем кесарева сечения забирали фрагменты пуповин (7-10 см). Получение и культивирование фибробластоподобных клеток из донорского материала было выполнено по разработанному способу. Характеристика полученных линий фибробластоподобных клеток приведена в таблице 1. Клеток имели высокий индекс адгезии (88±0,2% - 90,5±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,5±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 89,5 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденных может использоваться в специализированных лабораториях культур клеток для получении клеточных продуктов для регенераторной медицины:, в исследовательских целях для тестирования in vitro.

Информационные источники

1. Патент RU 22308957. от 27.10.2007 «Способ получения препарата для мезотерапии и препарат, полученный этим способом» Ярыгин К.Н.

2. Патент RU 2384618 от 27.03.2008 «Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного» Сабурина И.Н, Исаев А.А., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Кошелева Н.В., Мелихова B.C., Приходько А.В.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного, включающий забор и подготовку пуповины; ее механическое измельчение; ферментативную обработку; выделение суспензии клеток в результате процессов фильтрования и центрифугирования, отличающийся тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения; пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10 жизнеспособных кл./см в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в СО-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 122 items.
26.08.2017
№217.015.e95f

Способ лечения хронических ран

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, в частности к местному лечению хронических ран. Предварительно санированную рану укрывают биопластической мембраной «Коллост», фиксируя ее отдельными узловыми швами на расстоянии 0,3 мм друг от друга. Вблизи верхнего края раны устанавливают...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002627814
Дата охранного документа: 11.08.2017
29.12.2017
№217.015.f04b

Способ лазерного лечения диабетического макулярного отека

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано в лазерном лечении диабетического макулярного отека. Осуществляют наложение тестовых коагулятов вне зоны макулярного отека. В предоперационном периоде пациенту проводят оптическую когерентную томографию...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002629041
Дата охранного документа: 24.08.2017
29.12.2017
№217.015.f7f9

Способ определения у взрослых степени тяжести инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом эпштейна - барр

Изобретение относится к медицине, в частности к инфектологии, и касается оценки степени тяжести инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна - Барр у взрослых. Осуществляют измерение температуры тела человека, выявляют увеличение селезенки, печени и лимфатических узлов при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639596
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.f804

Способ лечения пациентов с эректильной дисфункцией

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии, андрологии и сексопатологии. Для лечения эректильной дисфункции ежедневно однократно в течение 10-12 минут проводят гравитационное воздействие на пациента в направлении голова-нижние конечности. Скорость вращения при первых двух...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639457
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.f812

Способ неинвазивного определения стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для неинвазивного определения стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом. Пациенту проводят общее и биохимическое исследование крови и УЗИ органов брюшной полости. Определяют возраст, абсолютное содержание...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639432
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.f9d6

Способ внутриротовой пневмостимуляции тканей челюстно-лицевой области

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и предназначено для использования при лечении патологий жевательной мускулатуры, касается способа пневмостимуляции тканей челюстно-лицевой области. В боковые отделы одного из принимающих лож двухсторонней внутриротовой каппы для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639436
Дата охранного документа: 21.12.2017
19.01.2018
№218.016.0292

Сироп календулы лекарственной

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к сиропу календулы лекарственной. Сироп календулы лекарственной включает водное извлечение цветков календулы лекарственной и сорбит, при этом его готовят на основе 64,0 г сорбита и 36,0 г водного извлечения, получаемого...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630058
Дата охранного документа: 05.09.2017
19.01.2018
№218.016.07b6

Способ медикаментозной поддержки пациентов при выполнении костно-пластических операций

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для медикаментозной поддержки пациентов при выполнении стоматологических костно-пластических операций. За семь дней до операции и на протяжении трех недель после операции пациенту вводят препарат Трентал в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631416
Дата охранного документа: 21.09.2017
13.02.2018
№218.016.1ea5

Способ получения препарата на основе гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения препарата на основе гиматомелановых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. Способ получения препарата на основе гиматомелановых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, заключающийся в том, что...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641046
Дата охранного документа: 15.01.2018
10.05.2018
№218.016.3a9d

Способ верхнечелюстной синусотомии

Изобретение относится к медицине, а именно к челюстно-лицевой хирургии и стоматологии, а так же оториноларингологии, и предназначено для использования при лечении заболеваний верхнечелюстного синуса, требующих доступа в полость синуса. Доступ в верхнечелюстной синус осуществляют со стороны...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002647610
Дата охранного документа: 16.03.2018
Showing 1-10 of 34 items.
27.02.2013
№216.012.29dd

Способ изготовления биоимплантатов из соединительных тканей

Изобретение относится к медицине, конкретно к биотехнологии. Описан способ изготовления биоимплантатов из соединительных тканей, основанный на предварительной механической обработке, отмывке имплантатов водой, воздействии на них липосистемами и перекисью водорода, далее воздействии на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476244
Дата охранного документа: 27.02.2013
20.03.2015
№216.013.3411

Способ дентальной имплантации (варианты)

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и предназначено для использования при проведении дентальной имплантации. Проводят разрез слизистой оболочки. Отслаивают и откидывают слизисто-надкостничный лоскут. Производят фиксирование предварительно подготовленного хирургического...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002544804
Дата охранного документа: 20.03.2015
10.05.2015
№216.013.48be

Модифицированный способ оперативного доступа к лопатке в эксперименте на крысе

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, патологической анатомии и патологической физиологии. Проводят общее обезболивание. Выполняют разрез кожи длиной 1,5-2 см в проекции ости лопаточной кости, рассечение кожи, подкожно-жировой клетчатки, фасций; скелетирование...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002550129
Дата охранного документа: 10.05.2015
20.05.2015
№216.013.4be0

Способ оперативного доступа к лопатке в эксперименте на крысе

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, патологической анатомии и патологической физиологии. Выполняют общее обезболивание. Наносят разрез кожи длиной 1,5-2 см, рассекают кожу, подкожно-жировую клетчатку, фасцию. Производят скелетирование мышц, прикрепляющихся к...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002550938
Дата охранного документа: 20.05.2015
20.05.2015
№216.013.4c04

Способ оценки остеоинтеграции пористых проволочных материалов в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, патологической анатомии, патологической физиологии и может быть использовано для оценки остеоинтеграции пористых проволочных материалов в эксперименте. Способ включает забор костных блоков с изучаемым пористым проволочным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002550974
Дата охранного документа: 20.05.2015
10.09.2015
№216.013.7730

Способ лечения хронического гранулематозного периодонтита

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и предназначено для лечения хронического гранулематозного периодонтита. Обрабатывают корневой канал с использованием сочетания двух методик: Step Back и Crown-Down с помощью ручных К-, Н-файлов Pro-Endo от 15 до 22 размера по ISO....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002562101
Дата охранного документа: 10.09.2015
10.10.2015
№216.013.8228

Биоимплантационная смесь

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в стоматологической имплантологии в отделениях челюстно-лицевой хирургии и поликлинических стоматологических учреждениях. Биоимплантационная смесь для восстановления дефектов зубных рядов и лечения деструктивных и травматических...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002564917
Дата охранного документа: 10.10.2015
25.08.2017
№217.015.bbe6

Способ моделирования локального снижения минеральной плотности костной ткани у кроликов

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности к изучению состояний, связанных с локальным снижением минеральной плотности костей. Для моделирования этого состояния у кроликов вначале выбирают кость для моделирования. Выполняют местную инфильтративную анестезию, проводя...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002615902
Дата охранного документа: 11.04.2017
25.08.2017
№217.015.bd26

Способ пластики альвеолярного отростка челюсти

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургической стоматологии, и предназначено для использования при пластике альвеолярного отростка нижней челюсти перед выполнением дентальной имплантации. Перед операцией на основании компьютерной обработки результатов исследования пациента...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002616337
Дата охранного документа: 14.04.2017
25.08.2017
№217.015.c73e

Способ открытого синус-лифтинга при дентальной имплантации

Изобретение относится к медицине, а именно к челюстно-лицевой хирургии, и предназначено для использования при проведении реконструктивно-восстановительных операций. Предварительно до проведения оперативного вмешательства производят компьютерную томографию пациента. Данные компьютерной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002618951
Дата охранного документа: 11.05.2017
+ добавить свой РИД