Способ сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro

Изобретение относится к медицине, а именно к сравнительному исследованию эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro.

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ оценки гемостатического эффекта жидких кровоостанавливающих средств» (Патент РФ №2286569 от 30.03.2005). Способ заключается в том, что для оценки гемостатического эффекта жидких кровоостанавливающих средств в лабораторных условиях берут стабилизированный 3,8%-ным раствором цитрата натрия 1 мл крови пациента. Далее вводят по каплям 0,1-0,2 мл жидкого кровоостанавливающего средства и при помощи стеклянной палочки все перемешивают. Включают секундомер и отмечают наличие гемостатического эффекта при по явлении сгустков крови в течение не более одной минуты.

Основными недостатками предлагаемого способа является высокая погрешность метода, возникающая в результате визуальной регистрации результатов исследования, отсутствия использования в методике аппаратов, позволяющих выполнить точную регистрацию времени свертывания крови, а также значительное влияние внешних факторов (скорость вращения стеклянной палочки, степень очистки палочки, температура внешней среды, влажность и пр.).

Техническим результатом изобретения является разработка способа сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro, обладающего технической простотой, точностью, объективностью и возможностью использования в скрининговых исследованиях при разработке экспериментальных образов гемостатических средств локального действия.

Технический результат достигается тем, что для сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro используется исследование концентрации кальция в плазме крови до и после погружения в кровь тестируемых материалов с помощью набора реактивов и автоматического биохимического анализатора.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Подготовку исследуемых материалов и стандартизацию их размеров производят с помощью инструмента для биопсии кожи - Dermo-Punch. Из полотна локального кровоостанавливающего средства с помощью Dermo-Punch получают цилиндр диаметром, равным внутреннему сечению Dermo-Punch и вакутайнера соответственно. Образцы и вакутайнеры раздельно выдерживают в термостате при температуре +37°С в течение 10 минут перед началом эксперимента для достижения уровня средней температуры тела человека.

В стерильных условиях, при комнатной температуре, натощак, в утренние часы у здоровых доноров-добровольцев (юноши 19-23 года), не имеющих в анамнезе заболеваний системы гемостаза, с письменного согласия, соблюдая правила асептики и антисептики забирают кровь из локтевой вены вакуумным способом в вакутайнеры, содержащие активатор свертывания.

В течение 15 секунд с момента взятия крови на дно вакутайнера (для максимального контакта крови донора и образца) погружают тестируемый образец. Далее пробирки вновь закупоривают и помещают в термостат, где инкубируют в течение 30 минут при температуре +37°С, что соответствует времени образования и организации сгустка крови согласно данным литературы.

Затем пробирки с образцами центрифугируют 10 минут со скоростью 3000 об/мин для получения сыворотки крови. Полуавтоматической пипеткой отбирают полученную таким образом сыворотку и выполняют исследования с помощью набора реактивов и автоматического биохимического анализатора. Оценивают концентрацию кальция, который является одним из ключевых факторов свертывания. Согласно каскадной теории механизмов коагуляции (Davie E.W., Ratnoff O.D., Macfarlane R.G., 1964 г.) кальций вступает в реакцию превращения протромбина в тромбин, а также участвует в активации X фактора (Стюарта-Прауэра) и тем самым играет важную роль в процессе свертывания крови. При сравнении значений концентрации кальция в плазме крови с контрольной группой, в которой не производилось погружение образца в кровь донора, и между группами исследования результаты интерпретируют следующим образом: о выраженной эффективности, иными словами кровоостанавливающей активности, локального кровоостанавливающего средства, говорят в случае, если значения концентрации кальция меньше, чем у остальных сравниваемых средств.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Апробацию способа проводили на образцах, обладающих, согласно данным производителя, гемостатическим эффектом (обусловленным физико-механическими и химическими свойствами образца): губка гемостатическая коллагеновая (состав: коллаген, субстанция - раствор 2% - 49 г (0,98 г сухого коллагена) нитрофурал (фурацилин) - 0,0075 г, борная кислота - 0,0125; размеры 50×50×7 мм; производитель: ОАО «Лужский завод «Белкозин», г. Луга, Россия); а также на материалах, априори не обладающих кровоостанавливающей активностью (гемостатическая активность которых может быть обусловлена лишь структурными, а не химическими, особенностями образца): губка бытовая (состав: поролон; размеры 130 мм × 90 мм × 50 мм, производитель: ООО «Поролон-Техно», г. Москва, Россия).

Подготовку материалов и стандартизацию их размеров производили с помощью инструмента для биопсии кожи - Dermo-Punch (диаметр - 0,9 см). Из полотна хирургического материала с помощью Dermo-Punch получали цилиндр диаметром 0,9 см равный внутреннему сечению Dermo-Punch и вакутайнера соответственно.

Образцы и вакутайнеры раздельно выдерживали в термостате при температуре +37°С в течение 10 минут перед началом эксперимента.

Исследование проводили в трех экспериментальных группах:

1 группа - цельная кровь донора, без тестируемого образца (контрольная группа);

2 группа - губка поролоновая + цельная кровь донора;

3 группа - губка гемостатическая коллагеновая + цельная кровь донора.

Исследования проводили в стерильных условиях операционного блока лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России (г. Курск) при комнатной температуре. Натощак в утренние часы у 10 здоровых доноров-добровольцев (юноши 19-23 года), не имеющих в анамнезе заболеваний системы гемостаза, с письменного согласия, соблюдая правила асептики и антисептики забирали кровь объемом 4 мл из локтевой вены вакуумным способом в вакутайнеры, содержащие активатор свертывания.

Для каждой серии тестов от одного донора кровь забирали в 3 пробирки (согласно количеству групп исследования). В каждой экспериментальной группе выполняли по 10 гематологических исследований (согласно числу доноров). В течение 15 секунд с момента взятия крови на дно пробирки погружали тестируемый образец, далее пробирки вновь закупоривали и помещали в термостат, где инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С.

Затем пробирки с образцами центрифугировали 10 минут со скоростью 3000 об/мин для получения сыворотки крови. Полуавтоматической пипеткой отбирали полученную таким образом сыворотку и выполняли исследования с помощью набора реактивов и автоматического биохимического анализатора ACCENT 200. Оценивали концентрацию кальция.

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением методик описательной и вариационной статистики - Me [25;75]). Достоверность отличия средних величин определяли с помощью критерия Краскела-Уоллиса (U), при допустимом для медико-биологических исследований значений р≤0,05.

Согласно полученным результатам, представленным в таблице, следует, что значение Са плазмы крови в группе 1 в 1,5 раза больше, чем в группе 2, и в 2 раза больше группы 3, при этом во 2 экспериментальной группе на 0,6 больше, чем в 3. Отметим, что статистически значимыми являлись изменения показателей Са плазмы крови во 2 и 3 группе. Таким образом, при внесении в кровь хирургических материалов отмечается изменение значения концентрации Са плазмы крови.

Примечание. Знаком «*» отмечены статистически значимые значения (при р≤0,05)

р (1-2) - достоверность отличия средних значений между значениями исследуемых показателей 1 (контрольная группа) и 2 (губка поролоновая + цельная кровь донора) экспериментальных групп.

р (1-3) - достоверность отличия средних значений между значениями исследуемых показателей 1 (контрольная группа) и 3 (губка гемостатическая коллагеновая + цельная кровь донора) донора экспериментальных групп.

р (2-3) - достоверность отличия средних значений между значениями исследуемых показателей 2 (губка поролоновая + цельная кровь донора) и 3 (губка гемостатическая коллагеновая + цельная кровь донора) донора экспериментальных групп.

Таким образом, разработан способ сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro, обладающего технической простотой, точностью, объективностью и возможностью использования в скрининговых исследованиях при разработке экспериментальных образов гемостатических средств локального действия.