Способ стимуляции регенерации инфицированных ран кожи и мягких тканей с применением пептида Gly-His-Lys-D-Ala

Изобретение относится к медицине (хирургии, дерматологии, патофизиологии и фармакологии) и ветеринарии, может быть использовано для стимуляции заживления инфицированных ран кожи и мягких тканей.

Наиболее близким к заявляемому способу является стимуляция заживления кожных ран при парентеральном применении регуляторного пептида Gly-His-Lys (Курцева А.А., Влияние регуляторного пептида глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на регенерацию кожи и функцию нейтрофилов. Автореферат дисс. канд. мед. наук, Курск, 2008, с. 15-18). Наибольшая ранозаживляющая активность проявлялась при десятикратном (с интервалом в 24 часа между инъекциями) внутрибрюшинном или внутрикожном введении пептида Gly-His-Lys в разовой дозе 0,5 мкг/кг массы тела.

В литературе описано модулирующее влияние пептида Gly-His-Lys в регуляции процессов роста и дифференцировки клеток (Kato K., Kasai S., Onodera K. et al. Effect of hepatocyte growth factor on the proliferation of transplanted hepatocytes in the spleen // Transplant. Proc., 1997, vol. 29, №4, p. 2029-2031; Sporn M.B., Roberts A.B. Transforming growth factor-в: recent progress and new challenges // J. Cell Biol., 1992, vol. 119, №5, p. 1017-1021). Некоторыми исследователями доказано влияние данного пептида как стимулятора ранозаживления, так как известен его стимулирующий эффект на синтез коллагена фибробластами (Maquart F.X., Bellon G., Chaqour В. et al. In vivo stimulation of connective tissue accumulation by the tripeptidecopper complex glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ in rat experimental wounds // J. Clin. Invest, 1993, vol. 92, №5, p. 2368-2376). Известны также стимулирующее влияние пептида на рост волос (Trackhy R.E., Fors T.D., Pickart L., Uno H. The hair follicle-stimulating properties of peptide copper complexes. Results in C3H mice // Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1991, vol. 642, №10, p. 468-469) и противовоспалительный эффект, связанный с уменьшением выделения железа из ферритина в поврежденных тканях (Miller D.M., DeSilva D., Pickart L., Aust S.D. Effects of glycyl-histidyl-lysyl chelated Cu(II) on ferritin dependent lipid peroxidation // Adv. Exp. Med. Biol., 1990, vol. 264, p. 79-84). Однако в литературе нет данных об использовании аналогов данного пептида, в частности, для лечения инфицированных ран кожи и мягких тканей.

Технический результат изобретения: разработать способ стимуляции регенерации инфицированных ран кожи и мягких тканей с применением пептида Gly-His-Lys-D-Ala.

Технический результат достигается тем, что экспериментальному животному (крысе) моделируют инфицированную рану кожи и мягких тканей, через 24 часа обрабатывают ее раствором 3% перекиси водорода, удаляют нежизнеспособные ткани и инородные частицы, производят остановку кровотечения и парентерально внутрикожно вводят в края раны пептид Gly-His-Lys-D-Ala в дозировке 0,5 мкг/кг массы тела в объеме 0,1 мл один раз в сутки в эквимолярных дозах в течение 10 дней.

Изобретение поясняется фигурами (фиг. 1-4) и таблицей.

На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий динамику изменения площади раны (в %) при использовании пептидов Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг и Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг по сравнению с контролем (р<0,05, начиная с 3-их суток).

На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий динамику изменения скорости заживления раны при использовании пептидов Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг и Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг по сравнению с контролем (р<0,05, начиная с 3-их суток).

На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий динамику изменения показателей клеточного индекса при использовании пептидов Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг и Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг по сравнению с контролем (р<0,05).

На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий динамику изменения клинических признаков течения раневого процесса при использовании пептидов Gly-His-Lys в дозировке 0,5 мкг/кг и Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг по сравнению с контролем (р<0,05).

Способ осуществляется следующим образом.

Пептид Gly-His-Lys-D-Ala, имеющий формулу H₂N-Gly-His-Lys-D-Ala-COOH, можно синтезировать в лаборатории синтеза пептидов. Нами был исследован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета.

Экспериментальному животному (крысе, мыши) на холке моделируют инфицированную рану кожи и мягких тканей. Через 24 часа производят обработку инфицированной раны 3% раствором перекиси водорода, иссечение нежизнеспособных, инфицированных краев и дна раны, остановку кровотечения. Заранее подготовленные навески пептида Gly-His-Lys-D-Ala растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия и разводят до получения необходимой дозы 0,5 мкг/кг массы тела. Экспериментальному животному после обработки раны пептид Gly-His-Lys-D-Ala вводят парентерально внутрикожно в края раны в дозе 0,5 мкг/кг массы тела в объеме 0,1 мл один раз в сутки в эквимолярных дозах в течение 10 дней. Точки введения препарата ежедневно меняли на 2 противоположные стороны раны.

Пример конкретного использования

Эксперимент in vivo проводили на крысах-самцах Wistar массой 180-220 г. Для исследования отбирали животных без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в виварии КГМУ. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе в свободном доступе, при температуре воздуха в помещении 22-24С°, световом режиме: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. Исследования проводили с соблюдением принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным и в соответствии с решением регионального этического комитета. Объектами исследования являлись раневые биоптаты. Раневой процесс моделировали в условиях этанолового внутрибрюшинного наркоза согласно методике Хотинян В.Ф. (1984 г.) нанесением на холке послойной раны стандартного размера (1,5×1,5 см). Сразу после моделирования раневого процесса, а также на 1-е, 3-и, 7-е и 10-е сутки раны фотографировали цифровой камерой Sony DSC-W210 с применением миллиметровой сетки с последующим измерением начальной, промежуточной и конечной площадей ран. После данных измерений производили обработку раневой поверхности 3% раствором перекиси водорода, удаляли нежизнеспособные ткани и инородные частицы, осуществляли остановку кровотечения. В дальнейшем подопытным животным однократно в сутки в течение 10 дней вводили внутрикожно предварительно растворенный в физиологическом растворе пептид Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг массы тела в объеме 0,1 мл в двух точках по границе раны. Ежедневно места введения препаратов меняли на две противоположные стороны. В контрольной группе животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,1 мл) также в течение 10 суток. В группе сравнения использовали ранее исследованный трипептид Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг массы тела в эквивалентном объеме (0,1 мл) как наиболее эффективной для стимуляции заживления ран кожи и мягких тканей.

Вычисление площадей ран осуществлялось с помощью программы Image Tool. На основании полученных данных вычисляли процент уменьшения площади раны (т.е. процент заживления раны) по формуле: ПУП=(S₀-S)×100/S₀, где ПУП - процент уменьшения площади, S₀ - исходная средняя площадь ран на начало лечения, мм², S - средняя площадь ран на момент измерения, мм²; скорость ее заживления (т.е. процент уменьшения площади за сутки) вычисляли по формуле: СЗ=ПУП₁-ПУП₀/Т, где СЗ - скорость заживления, ПУП₁ - процент уменьшения площади ран от исходной на момент измерения, ПУП₀ - процент уменьшения площади ран при предыдущем измерении, Т - количество дней между измерениями. При цитологическом исследовании раневого процесса был использован «метод отпечатков», разработанный М.П. Покровской и М.С. Макаровым (Раны и раневая инфекция: рук. для врачей / под ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченко. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1990. - С. 592). Мазки фиксировали смесью Никифорова и окрашивали по способу Романовского-Гимза. При исследовании мазков-отпечатков подсчитывали 100 клеток, рассчитывали клеточный индекс, который выражали в процентах.

Достоверность полученных результатов определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 в сравнении с показателями контрольной группы

Полученные результаты свидетельствуют о более выраженной стимуляции процессов заживления ран кожи и мягких тканей в группе животных при использовании пептида Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг по сравнению с животными, которые получали пептид Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг и контролем (табл. 1).

Таким образом, использование пептида Gly-His-Lys-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг стимулирует заживление инфицированных ран кожи и мягких тканей. Данный способ базируется на применении аналога регуляторного пептида Gly-His-Lys, а именно Gly-His-Lys-D-Ala, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным действием и полифункциональностью, не является трудоемким и не требует использования сложного оборудования.