Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЁЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕСТОВ IN VITRO

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к способу получения высокоактивного антигена из вакцинного штамма Brucella (В.) abortus 19 ВА и может быть использовано для постановки антигенстимулированных клеточных реакций in vitro для оценки формирования поствакцинального иммунитета против возбудителя бруцеллеза.

Для исследования специфического клеточно-опосредованного иммунитета против возбудителя бруцеллеза ранее была предложена кожно-аллергологическая реакция с бруцеллином (проба Бюрне). Но в связи с высоким риском развития общих и местных побочных реакций в настоящее время ведутся разработки антигенспецифических методов in vitro, которые позволяют оценить формирование и напряженность клеточного иммунитета в тестах in vitro. Исследователями продемонстрирована высокая эффективность применения методов антигенной активации лейкоцитов in vitro с использованием технологии проточной цитометрии для изучения формирования поствакцинального иммунитета [1, 2, 3, 4].

Для разработки наиболее диагностически информативных методик постановки антиген-стимулированных клеточных тестов in vitro, необходим тщательный подбор стимулирующего агента (антигена), обладающего достаточным активирующим потенциалом на Т-лимфоциты и обеспечивающим специфичность реакции в условиях in vitro.

В настоящее время нет коммерчески доступного бруцеллезного антигена для клеточных тестов in vitro.

Известен способ получения антигена, предназначенного для постановки серологических реакций (реакции непрямой гемагглютинации и связывания комплемента) на выявления противобруцеллезных антител. Способ включает культивирование возбудителя бруцелл в жидкой питательной среде с последующим выделением целевого продукта. Культивирование ведут при температуре 39-40°С в течение 18-24 ч с последующим повышением температуры до 45-50°С в течение 6-10 ч и повышением температуры до 60°С в течение 1-2 ч с дальнейшем отделением бакмассы и выделением антигена из культуральной среды методом ультрафильтрации или хроматографии получают бруцеллезный антиген, представляющий собой вещество в котором определяются сахара по методу Дюбуа до 40%, белки по методу по Лоури до 30% и нуклеотиды спектрофотометрическим методом до 20% с молекулярной массой 10-20 кДа [5]. Однако использование данного способа позволяет получить антиген бруцелл, предназначенный только для постановки иммуно-серологических реакций, при помощи которых можно проводить оценку уровня антител у животных в ответ на введение противобруцеллезных вакцин.

Известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма В. abortus 19 ВА для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий получение посевного материала (штамма В. abortus 19 ВА) на плотной питательной среде, его глубинное культивирование в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт и воду, концентрирование и очистку выросшей бакмассы на ультрафильтрационной установке при помощи аппаратов разделительных с использованием 0,5% фенолизированного физиологического раствора, и инактивацию антигена в биореакторе при температуре 80°С в течение часа [6]. Однако используемый метод концентрирования бактериальной массы на ультрафильтрационных колонках является недостаточно эффективным, энерго- и трудозатратным, включает операции сбора и стерилизации ультрафильтрационной установки, требует непрерывного контроля за процессом фильтрации. Кроме того, при использовании ультрафильтрационной колонки существует риск потери бакмассы и ее контаминации посторонней микрофлорой из-за разрыва волокон кассет.

Известен также способ изготовления бруцеллезного антигена для «Роз бенгал пробы» (РБП). Способ включает получение посевного материала и производственное культивирование штамма В. abortus 19 ВА в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой аутолизат и воду. Культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19-21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования. Выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15-50 кД. Инактивируют нагреванием. Окрашивают роз-бенгалом с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацией целевого продукта [7]. Однако недостатки, перечисленные выше, характерны и для данного технического решения.

Все антигены, получаемые вышеописанными способами, представляют собой комплексные вещества поверхностного слоя клеточной стенки бруцелл и используются для разработки диагностических препаратов, предназначенных для выявления специфических антител.

Наиболее близким аналогом является способ получения бруцеллезного антигена, предложенный Е.Н. Афанасьевым (1983), заключающийся в культивировании штаммов бруцелл разных видов на плотной питательной среде с последующей инактивацией бакмассы двойным объемом холодного (минус 30°С) ацетона при 4°С, 48 часов. Затем дважды отмывается физиологическим раствором путем центрифугирования при 4000g 20 мин. Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность биомассу экстрагируют 2,5% раствором NaCl в течение 48 ч. Далее центрифугируют при 4000 g в течение 60 мин. После центрифугирования отделяют (I) супернатант от осадка. Микробные клетки, находящиеся в осадке, разрушают в камере Х-пресс дезинтегратора. На следующем этапе биомассу подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугированию при 20000 g в течение 60 мин. После центрифугирования отделяют (II) супернатант от осадка. Осадок экстрагируют 2,5% раствором NaCl с дальнейшим центрифугированием при 20000 g в течение 60 мин. Образовавшийся осадок удаляют. Все полученные супернатанты объединяются и диализируются против дистиллированной воды в течение 48 ч. Полученный антиген лиофилизируют. Количество белка составляет 25-28 мг/мл [8].

Все представленные выше способы позволяют получить антиген, предназначенный исключительно для постановки серологических реакций (поиск антител).

Для постановки теста активации базофилов in vitro исследователями предложено использование аллергена бруцеллезного жидкого - «Бруцеллин» (производство НПО «Микроген») [9].

Однако предварительно проведенные исследования указали на низкую специфическую активность бруцеллина в отношении активации Т-лимфоцитов. Учитывая, что клеточный иммунитет, является ведущим в иммунологической защите от бруцеллезной инфекции, низкая активность бруцеллина в отношении Т-клеток не позволяет оценивать специфическую реактивность клеточных факторов специфической резистентности после иммунизации против бруцеллеза.

Задачей изобретения является получение антигенного комплекса из бруцелл, путем эффективного способа изоляции специфических компонентов клетки из бактериальных масс возбудителя бруцеллеза для использования в клеточных тестах in vitro с целью оценки специфической реактивности клеточного иммунитета после вакцинации против бруцеллеза (оценка иммунологической эффективности вакцинации).

Поставленная задача решается получением посевных культур В. abortus 19 ВА IV генераций с процессом накопления биомассы; обеззараживания микробной массы охлажденным до минус 40°С ацетоном; высушиванием микробной массы; выделением из микробной массы действующего вещества - бруцеллезного полисахаридно-белкового комплекса (БПБК) с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и маркировкой ампул с полученным продуктом.

На стадиях приготовления посевных культур проводят контроль на отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов, определяют концентрацию микробных клеток, проводят контроль специфической стерильности обеззараженной бактериальной массы бруцелл; на этапе приготовления БПБК определяют концентрацию белка, рН, активность, специфичность.

Работы с культурой штамма В. abortus 19 ВА проводят с соблюдением СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

Технический результат изобретения заключается в том, что культуру рассевают на агаре Альбими, разлитого в чашки Петри и выращивают при температуре (37±1)°С, (48±1) ч (2 генерация). После чего производят пересев на косяки агара Альбими, разлитого в пробирки, выращивают при температуре (37±1)°С, (48±1) ч (3 генерация). Культуру со скошенного агара в пробирках смывают 0,9% раствором NaCl и засевают на бактериологические матрацы с агаром Альбими, выращивают (72±1) ч при температуре (37±1)°С (4 генерация). Для обеззараживания бруцеллезного микроба используют холодный (минус 40°С) ацетон. Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность биомассу бруцеллезных микробов разливают по чашкам Петри на 18-20 ч для испарения ацетона, получая сухую биомассу, в которую вносят 2,5% раствор NaCl 1:1 для экстракции, на сутки. Далее центрифугируют при 12000 g в течение 40 мин. Осадок, полученный после центрифугирования биомассы и растворенный в 0,9% растворе NaCl рН 7,2 в соотношении 1:1 помещают в камеру гидравлического Х-пресс дезинтегратора клеток («Х-25 Пресс» ЛКБ, Швеция), предварительно охлажденного в течение 3 ч при температуре минус 40°С.Микробные клетки в дезинтеграторе замораживают при той же температуре в течение 12 ч. После этого проводят разрушение клеток на гидравлическом прессе, четырехкратно продавливая биомассу через калиброванное отверстие патрона дезинтегратора. Далее биомассу размораживают и центрифугируют при 12000 g в течение 40 минут. В супернатанте получают БПБК.

Степень разрушения микробных клеток оценивали при световой микроскопии (ув. 1000). Активность БПБК контролировали в реакции иммунодиффузии (РИД), которая составила 1:128, рН раствора 7,2±0,2. Общая концентрация белка в исследуемых образцах - 536 мкг/мл (количественную оценку содержания белка проводили методом специфической флуоресценции (флуориметр Qubit 2.0, LifeTechnologies, США). Так же был определен качественный состав гидролизата БПБК методом ионнообменной хроматографии с рефрактометрической детекцией. Характерными для антигена оказались следующие моносахариды - рамноза и D-глюкоза. Полученный антиген лиофилизировали, для увеличения срока его годности, вследствие чего появилась возможность его транспортирования без соблюдения холодовой цепи.

Специфическую активность полученного бруцеллезного антигенного комплекса оценивали в клеточных тестах in vitro. В качестве объекта исследования использованы белые лабораторные мыши (n=50), иммунизированные вакциной против бруцеллеза на основе штамма Brucella В. abortus 19 ВА (НПО «Микроген» Минздрава России) в дозе 3,4×10⁸-4,6×10⁸ живых микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольную группу (n=50) составили лабораторные мыши, которым вводили стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Взятие крови у иммунизированных и контрольных биомоделей осуществляли до вакцинации и на 14 сутки после иммунизации. Исследования проводили на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США), используя моноклональные антитела (МКАТ) к поверхностным антигенам Т-лимфоцитов мыши. Определяли активационные молекулы CD25, CD69, экспрессированные на Т-лимфоцитах. Популяцию лимфоцитов идентифицировали при помощи гейтирования в координатах FSC-SSC на графике Dot Plot (программное обеспечение BD Cell Quest^Tm). События, попавшие в регион лимфоцитов анализировали на предмет экспрессии CD3⁺CD69⁺, CD3⁺CD25⁺ рецепторов. Использованные МКАТ (Invitrogen, США) были мечены FITC (флуоресцеинизотиоцианат) и РЕ (фикоэритрин).

Для определения фоновых значений (фон) маркеров активации, стимуляцию лимфоцитов осуществляли стерильным физиологическим раствором. Реакцию активации учитывали через 24 ч после инкубации с БПБК в условиях in vitro.

Проведенные исследования показали, что интенсивность экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов в контрольной группе при стимуляции физиологическим раствором и БПБК не имела статистически значимой разницы во все сроки исследования. Это указывает на то, что БПБК не вызывает неспецифической реакции лимфоцитов in vitro. Так, уровень экспрессии маркера CD25, при стимуляции стерильным изотоническим раствором составил в среднем 2,47±0,46%, CD69-10,22±2,23%.

Исследования интенсивности экспрессии «ранних» активационных молекул после вакцинации показали, что на 14 сут после иммунизации фоновые значение не имели статистически значимой разницы - 3,73±0,40%, после инкубации с антигенным комплексом - БПБК уровень экспрессии рецептора к IL-2 (CD25) увеличился в 2,8 раза, составив в среднем 8,65±1,85%. Анализ специфической активности БПБК по маркеру ранней пролиферации лимфоцитов - CD69 показал, что на 14 суток после иммунизации антигенный комплекс способствовал увеличению, в сравнении с фоновыми значениями (23,07±1,87%), интенсивности экспонирования CD69 более чем в 2 раза - 46,81±4,53%.

Анализ результатов исследования показал, что БПБК, полученный из штамма В. abortus 19 ВА по модифицированной методике, обладает выраженной специфической активностью в условиях in vitro. БПБК не вызывает неспецифических реакций (активации) Т-лимфоцитов in vitro, что дает возможность использования его в качестве тест-антигена при постановке реакции антигенспецифической активации Т-лимфоцитов in vitro для оценки формирования адаптивного вакцинального иммунитета против бруцелл.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Культуру В. abortus 19 ВА рассевают на агаре Альбими, разлитого в чашки и выращивают при температуре (37±1)°С, (48±1) ч (2 генерация). После чего производят пересев на косяки агара Альбими, разлитого в пробирки, выращивают при температуре (37±1)°С, (48±1) ч (3 генерация). Культуру со скошенного агара в пробирках смывают 0,9% раствором NaCl и засевают на бактериологические матрацы, выращивают (72±1) ч при температуре (37±1)°С (4 генерация). Для инактивирования бруцеллезного микроба используют холодный (минус 40°С) ацетон. Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность биомассу бруцеллезных микробов разливают по чашкам Петри на 18-20 ч для испарения от ацетона, получая сухую биомассы, в которую вносят 2,5% раствора NaCl 1:1 для экстракции, на сутки. Далее центрифугируют при 12000 g в течение 40 мин на центрифуге. Осадок, полученный после центрифугирования биомассы и растворенный в 0,9% растворе NaCl рН 7,2 в соотношении 1:1 помещают в камеру Х-пресс дезинтегратора клеток («Х-25 Пресс» ЛКБ, Швеция), предварительно охлажденного в течение 3 ч при температуре минус 40°С.Микробные клетки в дезинтеграторе замораживают при той же температуре в течение 12 ч. После этого проводят разрушение клеток на гидравлическом прессе, четырехкратно продавливая биомассу через калиброванное отверстие патрона дезинтегратора. Далее биомассу размораживают и центрифугируют при 12000 g в течение 40 минут. В супернатанте получают БПБК. Активность антигена в РИД составила 1:128, рН раствора 7,2±0,2. Общая концентрация белка в исследуемых образцах - 536±2,0 мкг/мл. Выявлены моносахариды - рамноза и D-глюкоза.

Полученный антиген лиофилизировали, контролируя его физико-химические и биологические показатели. В течение года препарат оставался стабильным.

Результаты исследования специфической активности БПБК по показателям экспрессии Т-лимфоцитами маркеров активации CD25, CD69 указывают на высокий активационный потенциал антигенного комплекса. На 14 сут после вакцинации интенсивность антиген-индуцированной экспрессии Т-лимфоцитами CD25 оставила - 8,65±1,85% (фон - 3,73±0,40%), CD69 - 46,81±4,53% (фон - 23,07±1,87%). Таким образом, было установлено, что разработанный в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора БПБК на основе штамма В. abortus 19 ВА не вызывает неспецифических реакций (неспецифической активации) Т-лимфоцитови обладает выраженной специфической активностью в условиях in vitro. Результаты специфической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, однако после проведения разрушения клеток на гидравлическом прессе и центрифугирования при 12000 g в течение 40 минут биомассу экстрагируют 2,5% раствором NaCl с дальнейшим центрифугированием при 20000 g 60 мин. Образовавшийся осадок удаляют. Полученный антиген лиофилизируют. Активность антигена в РИД, была низкой и составила - 1:16, рН раствора 7,2±0,2. Общая концентрация белка в исследуемых образцах - 470±1,8 мкг/мл. Моносахариды - рамноза и D-глюкоза. Результаты исследования специфической активности антигена в лимфоцитарных тестах in vitro указали на его кране низкий стимулирующий потенциал в отношении Т-клеток - значения интенсивности экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов (CD25, CD69) при активации антигеном не имели статистически значимой разницы с фоновыми значениями (Таб. 1).

Пример 3. Аналогичен примеру 1, однако после проведения разрушения клеток на гидравлическом прессе и центрифугирования при 12000 g в течение 40 минут биомассу подвергают ультразвуковой дезинтеграции и центрифугируют при 20000 g в течение 60 мин. После центрифугирования отделяют (II) супернатант от осадка. Осадок - экстрагируют 2,5% раствором NaCl с дальнейшим центрифугированием при 20000 g 60 мин. Образовавшийся осадок удаляют. А все супернатанты объединяю и диализирую против дистиллированной воды 48 часов. Полученный антиген лиофилизируют. Активность антигена в РИД составила 1:64, рН раствора 7,2±0,2. Общая концентрация белка в исследуемых образцах - 986±2,5 мкг/мл. Моносахариды - рамноза и D-глюкоза. Полученный антиген лиофилизируют. Анализ результатов изучения интенсивности активирующего влияния антигена на Т-лимфоциты свидетельствовал об отсутствии индуцированной активации изучаемой популяции лимфоцитов, что указывает на низкий стимулирующий потенциал данного антигена (Таб. 1).

*- разница значений статистически значима при р≤0,05

Таким образом, предлагаемый способ получения антигена из бруцелл, путем изоляции специфических антигенных компонентов из бактериальной массы возбудителя бруцеллеза по примеру 1 является эффективным для постановки антигенстимулированных клеточных реакций in vitro. Использование разработанного антигена способствует повышению чувствительности клеточных реакций in vitro. Полученный экспериментальный антиген имеет реальную перспективу применения при разработке алгоритмов лабораторной диагностики бруцеллеза и оценки фактической привитости контингентов риска после вакцинации против бруцеллеза.

Используемая литература

1. Дармов И.В., Елагин Г.Д., Богачева Н.В., Крючков А.В., Тихвинская О.В. Современные лабораторные методы оценки эффективности проведения иммунизации против опасных и особо опасных инфекций // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №6. - С. 39-42

2. Куличенко А.Н., Абзаева Н.В., Гостищева С.Е., Ракитина Е.Л., Пономаренко Д.Г., Костюченко М.В. Использование антигенспецифических клеточных тестов in vitro для оценки формирования поствакцинального противочумного иммунитета // Инфекция и иммунитет. - 2017. - Т. 7. №2. - С. 203-208.

3. Фирстова В.В., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Зырина Е.В., Иванов С.А., Киселева Н.В., Копылов П.Х., Анисимов А.П., Дятлов И.А. Определение экспрессии маркера ранней активации CD69 на лимфоцитах иммунных мышей после стимуляции их антигенами чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций 2010. - №103. - С. 56-59.

4. Пономаренко Д.Г., Логвиненко О.В., Саркисян Н.С., Ракитина Е.Л., Голубь О.Г., Куличенко А.Н. / Новый подход к аллергодиагностике бруцеллеза // Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. №1. С. 89-92.

5. Патент РФ №2627897. Опубликован: 14.08.2017 Бюл. №23.

6. Патент РФ 2085212. Опубликован: 27.07.1997.

7. Патент РФ №2163141. Опубликован 20.02.2001. Бюл. №5.

8. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella / Е.Н. Афанасьев // дис. канд. мед. наук. Ставрополь. 1983

9. ФС Аллерген бруцеллезный жидкий (Бруцеллин). Взамен ГФ X, ст. 114, ФС 42 - 3552-98.