Способ сравнительного изучения влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro

Изобретение относится к медицине, а именно к сравнительному изучению влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro.

Наиболее близким к предлагаемому способу является «Способ сравнительной оценки гемостатических свойств хирургических материалов» (Патент РФ №2373532 от 09.09.2008). Способ заключается в том, что для оценки гемостатических свойств хирургических материалов используется метод электрокоагулографии нативной донорской крови с фиксированными ко дну кюветы фибриновым клеем хирургическими материалами.

Основными недостатками предлагаемого способа является высокая погрешность метода, возникающая в результате использования фибринового клея, искажающего результаты опытов, недостаточная для сравнительного изучения различных материалов точность вследствие технических особенностей используемого аппарата (электрокоагулограф выдает результаты на бумажном носителе и исследователь должен самостоятельно произвести расчет числовых значений). Объектом исследования для оценки времени свертывания с помощью электрокоагулографа является нативная кровь донора. Это обуславливает следующие неудобства для последнего: дополнительные, приводящие к гемоделюции, внутривенные вливания (с целью профилактики тромбообразования в месте стояния периферического венозного катетера), вследствие чего донору необходимо находиться в одном положении на протяжении длительного времени.

Техническим результатом изобретения является разработка способа сравнительного изучения влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro, обладающего технической простотой, точностью, объективностью и возможностью использования в скрининговых исследованиях, а также позволяющего проводить исследования в отдаленные сроки от момента взятия крови.

Технический результат достигается тем, что для сравнительного изучения влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro используется метод электрокоагулометрии стабилизированной раствором цитрата натрия донорской крови, рекальцифицированной для активации процессов коагуляции.

Изобретение поясняется фигурами:

Фиг. 1 - Вид тестируемых образцов;

Фиг. 2 - Кювета измерительная коагулометра с тестируемым образцом (схема);

Фиг. 3 - Кювета измерительная коагулометра АПГ2-02-П с помещенным образцом (вид сверху).

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

В стерильных условиях кровь доноров-добровольцев с письменного согласия, соблюдая правила асептики и антисептики, для исследования забирают из локтевой вены в вакутайнер, содержащий 3,2% раствор цитрата натрия - Na₃C₆H₅O₇. Соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Перемешивание крови с антикоагулянтом производят аккуратным переворачиванием вакутайнера 3 раза. При необходимости проведения исследований в отдаленные сроки от момента взятия крови образцы хранят при комнатной температуре не более 2 часов.

Перед исследованием производят рекальцификацию стабилизированной цитратом крови: в отдельную пробирку добавляют с помощью микропипетки 0,1 мл раствора тромбопластина, 0,1 мл 5% раствора кальция хлорида, затем вносят 0,5 мл цитратной крови.

После рекальцификации кровь из пробирки дозируют микропипеткой в объеме 200 мкл в кювету коагулометра, в которую после этого помещают стальной шарик и вносят тестируемые образцы различных хирургических материалов стандартного размера (цилиндрической формы с радиусом 0,5 см и высотой 0,2 см) (фиг. 1). Последние помещают в кювету таким образом, чтобы верхний край «цилиндра» соответствовал месту перехода узкой части кюветы в широкую (т.е. у верхней границы ее измерительной части) (фиг. 2) и был полностью, на всю толщину, погружен в кровь, и плотно прилегал к стенкам кюветы и не препятствовал вращению металлического шарика, расположенного на дне кюветы (фиг. 3).

Регистрацию времени свертывания крови (в секундах) производят в соответствии с инструкцией к коагулометру.

Запуск таймера (время начала исследования) производят вручную или автоматически (в зависимости от модели коагулометра). Образование сгустка фиксирует коагулометр по остановке движущегося в исследуемой пробе стального шарика. За время образования сгустка в исследуемой пробе принимают промежуток времени с момента введения в пробу различных хирургических материалов до момента остановки шарика. Момент остановки шарика электрокоагулометр определяет механическим способом по обработанному микропроцессорной схемой сигналу с датчика, который возникает при изменении реологических свойств пробы. По изменению величины времени свертывания до внесения хирургических материалов в исследуемую пробу и после судят об их влиянии на процесс образования сгустка крови in vitro.

Также учитывают время от начала рекальцификации крови (с помощью секундомера засекают время с момента введения в пробу растворов кальция хлорида и тромбопластина) до помещения в пробу хирургических материалов и запуска таймера, которое в последствие суммируют с показателями прибора. Каждое исследование включало в себя оценку времени свертывания в двух кюветах коагулометра одновременно, что позволило увеличить точность и снизить погрешность исследования.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Исследование проводили на крови, взятой в асептических условиях с письменного согласия у 10 здоровых доноров-добровольцев (юноши 19-23 лет), не имеющих в анамнезе патологий системы гемостаза. Для исследования забирали кровь из локтевой вены в вакутайнер, содержащий 3,2% раствор цитрата натрия. Соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Перемешивание крови с антикоагулянтом производили аккуратным переворачиванием вакутайнера 3 раза.

Перед исследованием производили рекальцификацию стабилизированной цитратом крови: в отдельную пробирку добавляли с помощью микропипетки 0,1 мл раствора тромбопластина, 0,1 мл 5% раствора кальция хлорида, затем вносили 0,5 мл цитратной крови.

Кровь из пробирки дозировали микропипеткой в объеме 200 мкл в кювету коагулометра АПГ2-02-П, в которую после этого помещали стальной шарик и вносили тестируемые образцы различных хирургических материалов стандартного размера (цилиндрической формы с радиусом 0,5 см и высотой 0,2 см). Последние помещали в кювету таким образом, чтобы верхний край «цилиндра» соответствовал месту перехода узкой части кюветы в широкую (т.е. у верхней границы ее измерительной части) и был полностью, на всю толщину, погружен в кровь, и плотно прилегал к стенкам кюветы, но не препятствовал вращению металлического шарика, расположенного на дне кюветы.

Подготовку материалов и стандартизацию их размеров производили с помощью инструмента для биопсии кожи - Dermo-Punch (диаметр - 0,5 см) и пластины-трафарета с отверстием диаметром 0,5 см и толщиной 0,2 см. Из полотна хирургического материала с помощью Dermo-Punch получали цилиндр диаметром 0,5 см равный внутреннему сечению Dermo-Punch и кюветы коагулометра соответственно. Затем помещали получившийся цилиндр в отверстие пластины трафарета, окно которой имеет форму круга с диаметром 0,5 см (равный внутреннему сечению Dermo-Punch и кюветы коагулометра) и толщину стенки 0,2 см, отсекали скальпелем выступающую над уровнем поверхности пластины часть цилиндра, тем самым определяя толщину тестируемого образца.

Апробацию способа проводили на образцах, обладающих, согласно данным производителя, гемостатическим эффектом (обусловленным физико-механическими и химическими свойствами образца): губка гемостатическая коллагеновая (состав: коллаген, субстанция - раствор 2% - 49 г (0,98 г сухого коллагена) нитрофурал (фурацилин) - 0,0075 г, борная кислота - 0,0125; размеры 50×50×7 мм; производитель: ОАО «Лужский завод «Белкозин», г. Луга, Россия); а также на материалах априори не имеющих кровооостанавливающей активности (гемостатическая активность которых может быть обусловлена лишь структурными, а не химическими, особенностями образца): губка бытовая (состав: поролон; размеры 130 мм × 90 мм × 50 мм, производитель: ООО «Поролон-Техно», г. Москва, Россия).

Запуск таймера коагулометра (время начала исследования) производили вручную после установки кювет в измерительные ячейки аппарата согласно инструкции к коагулометру АПГ2-02-П.

Исследования проводили в следующих группах:

- контрольная - исследуемый материал не вносили в кювету коагулометра;

- первая экспериментальная группа - кровь + губка гемостатическая коллагеновая производства ОАО «Лужский завод «Белкозин»;

- вторая экспериментальная группа - кровь + губка бытовая поролоновая производства ООО «Поролон-Техно».

С кровью каждого донора производили по 3 опыта. В каждой экспериментальной группе выполняли по 10 коагулометрических исследований (согласно числу доноров). Каждое исследование включало в себя оценку времени свертывания в двух кюветах коагулометра одновременно, что позволило увеличить точность и снизить погрешности исследования. Также учитывали время от начала рекальцификации крови (с помощью секундомера засекали время с момента введения в пробу растворов кальция хлорида и тромбопластина) до помещения в пробу хирургических материалов, которое в последствии суммировали с показателями прибора.

Согласно полученным результатам исследования, которые представлены в таблице, можно сделать вывод о том, что наибольшее значение среднего времени свертывания крови характерно для второй экспериментальной группы - 90,9 секунд, наименьшее - для первой экспериментальной группы - 71,7 секунд против значений контрольной группы - 94,6 секунд. Среднее время свертывания крови во 2 экспериментальной группе на 3,7 сек больше, чем в контрольной, а в 1 экспериментальной группе на 22,9 сек меньше по сравнению с контрольной группой. Время свертывания крови во второй экспериментальной группе на 19,2 сек. больше, чем в первой. Указанные различия были статистически достоверны (p≤0,05). Таким образом, время свертывания крови изменяется при внесении в кровь хирургических материалов.

p₁ - достоверность отличия средних значений времени свертывания крови в кюветах с губкой гемостатической коллагеновой «Белкозин» по отношению к кюветам с губкой бытовой поролоновой.

p₂ - достоверность отличия средних значений времени свертывания крови в кюветах с губкой бытовой поролоновой по отношению к кюветам со стабилизированной рекальцифицированной кровью.

p₃ - достоверность отличия средних значений времени свертывания крови в кюветах с губкой гемостатической коллагеновой «Белкозин» по отношению к кюветам со стабилизированной рекальцифицированной кровью.

Таким образом, разработан способ сравнительного изучения влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro, обладающий технической простотой, точностью, объективностью и возможностью использования в скрининговых исследованиях, а также позволяющий проводить исследования в отдаленные сроки от момента взятия крови.