СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ ГУБОК В МИКРОПРОБИРКАХ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ IN VITRO

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и к медицине, а именно к способу получения в микропробирках гемостатических, лечебных и других губок, содержащих основу и активные вещества, для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных исследований in vitro.

Известен способ лабораторного исследования, при котором на дно кюветы медицинским клеем фиксируется исследуемый хирургический материал (средства, применяемые в качестве гемостатических аппликационных имплантов, такие как губки на основе карбоксиметилцеллюлозы, коллагена) объемом 1 мм³. Обязательными условиями проведения сравнительного исследования являются стандартизация размеров исследуемых образцов, а также постановка контрольного опыта (в кювете коагулографа находится только необходимый объем нативной крови донора). Данный способ является недостаточно «чувствительным» вследствие того, что в процессе исследования имеет место интенсивное механическое воздействие со стороны измерительной ячейки электрокоагулографа на форменные элементы крови, что приводит к их деструкции, тем самым способствует выходу веществ, участвующих в процессе свертывания крови. Вместе с тем, за счет механического воздействия, вследствие разрушения нитей фибрина нарушается формирование фибриновой сети, что значительно снижает чувствительность, воспроизводимость и точность электрокоагулографии, делает невозможным выявление тонких сдвигов в сложной системе [Липатов В.А. К вопросу о методологии сравнительного изучения степени гемостатической активности аппликационных кровоостанавливающих средств / В.А. Липатов, С.В. Лазаренко, К.А. Сотников, Д.А. Северинов, М.П. Ершов // Новости хирургии - 2018. - Т. 26 - №1 - 81-95 с.].

Известна биомедицинская полисахаридная гемостатическая лечебная губка. Способ получения включает следующие стадии: во-первых, растворение полисахаридного материала карбоксиметилцеллюлозы, гиалуроновой кислоты или их смеси в щелочном растворе, достаточное перемешивание и набухание в коллоид; во-вторых, добавление сшивающего агента в коллоид, достаточное перемешивание, инкубацию в однородный гель и диализацию и очистку полученного геля; в-третьих, добавление глицерина в очищенный продукт и, наконец, проведение сублимационной сушки при низкой температуре для получения обезвоженной губки (патент CN 103480033).

Наиболее близким аналогом является патент РФ №2618896, в котором описана гемостатическая губка, содержащая основу и активное вещество, высушенные сублимационной сушкой.

К недостаткам известных технических решений является их неприспособленность для проведения скриннинговых и других исследований in vitro, такие системы изготавливаются на месте в лабораториях путем помещения навески губки, содержащей основу или основу и активные вещества в микропробирку на клеевую основу. Однако, при этом происходит повреждение структуры губки, что приводит к увеличению погрешности при проведении исследований.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа получения материалов для проведения лабораторных исследований in vitro, применение которой позволяет уменьшить погрешность при проводимых экспериментах.

Поставленная задача решается путем применения способа получения исследуемых губок в микропобирках для проведения лабораторных исследований in vitro, включающего в себя стадии приготовление композиции, помещение навески композиции в микропробирку, высушивание композиции методом лиофилизации. При этом лиофилизация происходит в следующем режиме:

- замораживание при атмосферном давлении при температуре +2,0°С в течение 330 мин, затем атмосферном давлении при температуре -50,0°С в течение 255 мин;

- лиофилизация при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 60 мин, затем при давлении 90 μбар при температуре -20,0°С в течение 1850 мин, затем при давлении 90 μбар при температуре +5,0°С в течение 780 мин;

- досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 мин.

При этом исследуемая губка включает основу и при необходимости гемостатически активные и/или лекарственные компоненты. Губка получена непосредственно в микропробирке сублимационной сушкой из растворов, гелей или золей, суспензий или дисперсных растворов, что позволяет избежать структурных повреждений губки и активных компонентов при их размещении в микропробирке. Так же в процессе сублимационной сушки происходит адгезивное сцепление поверхностей исследуемой губки и микропробирки, что фиксирует положение губки без использования медицинского клея.

Для получения губок одинакового объема, массы и пористости, помещенных в микропробирки, готовых к проведению различных лабораторных исследований in vitro, нами предложено приготовление водных растворов, золей или гелей, дисперсных растворов или суспензий, или других жидких лекарственных форм с взятыми в качестве основы альгинатом натрия или хитозаном, или каррагинаном, или целлюлозой, или другими природными или искусственными полимерными или белковыми соединениями. Состав губок может включать в качестве активных веществ белки крови, соли и соединения на основе металлов, растительные экстракты, минеральные вещества, ингибиторы фибринолиза, факторы свертывания крови, антибиотики, антисептики и другие. Значение рН итоговой смеси компонентов может варьироваться от 0,5 до 13,5. После приготовления одинаковые объемы (от 0,1 до 15,0 мл) растворов, золей или гелей, дисперсий или суспензий, с помощью микропипеток помещают в микропробирки.

Настоящим способом получения губок предусмотрено использование микропробирок, используемых в современной лабораторной практике, изготовленных из стекла или кварцевого стекла, полистирола или полипропилена, или других синтетических полимеров, применяемых в медицине, с коническим, плоским или круглым дном, градуированных или неградуированных, с защелкивающейся или винтовой крышкой, или с пробкой, бесцветных или окрашенных, стерильных или нестерильных, объемом от 0,1 до 15,0 мл, в том числе и пробирок типа «эппендорф».

Заполненные одинаковыми объемами водных растворов или гелей, или суспензий, или других жидких лекарственных форм микропробирки помещают в лиофилизатор и подвергают оптимальному режиму заморозки с последующей вакуумной сушкой и досушиванием. В результате в микропробирках получают одинаковые по объему, массе и пористости губки, с контактной поверхностью, идентичной губкам большого размера, применяемым в экспериментах in vivo, используемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных исследований in vitro.

Важнейшими параметрами при лиофильной сушке являются давление и температура. Стандартный процесс лиофильной сушки можно разделить на три этапа: замораживание, первичную сушку и вторичную сушку. Каждый этап предъявляет конкретные требования к давлению и температуре. Первоначально продукт замораживается при температуре, достаточно низкой для того, чтобы обеспечить полную заморозку. На первичной стадии сушки должны быть созданы условия, благоприятные для лиофилизации. В то же время важным является сохранение характеристик продукта, поэтому необходимо, чтобы температура оставалась ниже определенного значения, которое называют критической температурой. При температуре выше этого значения структура продукта разрушается, что приводит к усадке и растрескиванию. В идеале лиофильная сушка проводится при температурах чуть ниже критической. Давление в сушильной камере понижают, чтобы активировать процесс сушки.

Лиофилизация вызывает образование водяного пара в сушильной камере. Если пар не удалять из системы, он насыщается и частицы льда перестают сублимироваться. Частицы пара удаляются посредством ледового конденсора. Главная задача ледового конденсора - собирать водяной пар и другие конденсируемые газы. Молекулы воды естественным образом перемещаются к ледовому конденсору, чему способствует разница значений давления пара. Температура ледового конденсора должна быть значительно ниже температуры замороженного продукта - обычно на 15°С.

Раствор, золь или гель, дисперсию или суспензию, или другие жидкие лекарственные формы на основе природных или синтетических полимеров с добавлением или без добавления активных веществ объемом 1,0 мл с помощью пипетки-дозатора помещался в микропробирки. Требуемое количество микропробирок помещалось в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производилось замораживание при атмосферном давлении при температуре +2,0°С в течение 330 мин, затем атмосферном давлении при температуре -50,0°С в течение 255 мин. После окончания режима замораживания производилась лиофилизация при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 60 мин, затем при давлении 90 μбар при температуре -20,0°С в течение 1850 мин, затем при давлении 90 μбар при температуре +5,0°С в течение 780 мин. После окончания режима лиофилизации производилось досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 мин. В результате в микропробирках получали одинаковые по объему, весу и пористости губки, с контактной поверхностью, идентичной губкам большого размера, применяемым в экспериментах in vivo, используемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследования in vitro.

Пример 1.

0,1-3,0% раствор альгината натрия в дистиллированной воде объемом 0,2 мл с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки объемом 0,2 см³. Требуемое для исследований количество микропробирок с 0,1-3,0% раствора альгината натрия в дистиллированной воде объемом 0,2 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, применяемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследований.

Пример 2.

0,1-5,0% раствор поливинилпирролидона в дистиллированной воде объемом 15,0 мл с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки объемом 15,0 см³. Требуемое для исследования количество микропробирок с 0,1-5,0% раствором поливинилпирролидона в дистиллированной воде объемом 15,0 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, используемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследования.

Пример 3.

3,0-10,0% гель на основе альгината натрия объемом 0,2 мл с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки. Требуемое количество микропробирок с 3,0-10,0% гелем на основе альгината натрия объемом 0,2 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, используемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследования.

Пример 4.

10,0-30,0% гель на основе поливинилпирролидона объемом 15,0 мл с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки. Требуемое количество микропробирок с 10,0-30,0% гелем на основе поливинилпирролидона объемом 15,0 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, используемые в дальнейшем для проведения коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследования.

Пример 5.

В 3,0% растворе каррагинана в дистиллированной воде растворяют гемостатические средства: эпсилон-аминокапроновую кислоту, минеральные вещества с гемостатическим действием, пластификаторы при температуре 20°С и постоянном перемешивании на шейкере в течение 60 мин до получения однородной массы. Затем 0,2 мл полученной однородной массы с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки. Требуемое для исследования количество микропробирок с полученной однородной массой природных полимеров и активных веществ объемом 0,2 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, используемые в дальнейшем для проведения сравнительных коагулологических, микробиологических и других лабораторных методов исследования.

Пример 6.

В 10,0% геле на основе целлюлозы растворяют антибиотики, антимикробные средства и металлические соли при температуре 75°С и постоянном перемешивании на шейкере в течение 60 мин до получения однородной массы. Затем 15 мл полученной однородной массы с помощью пипетки-дозатора помещают в микропробирки. Требуемое для исследования количество микропробирок с полученной однородной массой природных полимеров и активных веществ объемом 15 мл помещают в лиофилизатор CS 15-0.7. Затем производят замораживание при давлении 1 бар при температуре +2,0°С в течение 330 минут, затем при температуре -50,0°С в течение 255 минут. После окончания режима замораживания производят лиофилизацию при давлении 90 μбар при температуре -50,0°С в течение 1850 минут, затем при температуре +5,0°С в течение 780 минут. После окончания режима лиофилизации проводят досушивание полученных губок при давлении 90 μбар при температуре +35,0°С в течение 660 минут. В результате в микропробирках получены одинаковые по объему, весу и пористости губки, используемые в дальнейшем для проведения лабораторных методов исследования.

Пример 7.

Изучение влияния раневого покрытия на остановку кровотечений проводили в лабораторных условиях на кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 3,0-4,5 кг со средним значением темпа кровотечения 1 г/мин согласно методике, описанной в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств», Часть первая, М: Гриф и К, 2012. Эксперимент выполнялся с введения животного в состояние тиопенталового наркоза. Затем выполнялась тотальная срединная лапаротомия, в образовавшуюся рану выводилась передняя поверхность печени. При помощи пластмассового ограничителя производилась резекция лезвием выступившей части печени. В результате образовывалась равномерно кровоточащая рана. В каждом опыте размер и форма срезанного сегмента оставались неизменными. Для сравнительной оценки гемостатических свойств исследуемого раневого покрытия опытного образца губки, полученной в микропробирке и образца контроля (размером 2 см × 2 см) на доле печени одновременно производились два вышеописанных среза. В качестве контроля использовался образец губки, используемый в экспериментах in vivo.

Пример 8.

Остановка капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполнялась путем одномоментного нанесения на раны образца губки, полученной в микропробирке, и образца губки, используемого в экспериментах in vivo. Губки хорошо адгезировали к ранам, обладали высокой гигроскопичностью, и полностью останавливали кровотечение за 69±4 с и 62±5 с соответственно.