Способ выявления предрасположенности к заболеванию атеросклерозом на основе определения экспрессии генов, вовлеченных в накопление холестерина

Изобретение относится к медицине, медицинской генетике, кардиологии, а именно к ранней диагностике атеросклероза. Предложен способ генодиагностики и/или определения предрасположенности к атеросклерозу.

Атеросклероз представляет собой патологическое ремоделирование артерий, которое является основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах; эта патология лежит в основе инфаркта миокарда, инсульта и заболевания периферических артерий. Существует необходимость в прогностических и легко доступных маркерах атеросклероза, которые могут быть определены в образцах периферической крови. Как известно, наследственность определяет до 50% риска развития атеросклероза, но практически не учитывается в клинических шкалах оценки риска его развития. Генетические маркеры уже используются в практической медицине в виде Gene` с Risk Scores (Шкал оценки генетического риска), однако предсказательная ценность GRS в дополнении к клиническим шкалам оценки риска небольшая, поэтому применение шкал оценки генетического риска в настоящее время в профилактической медицине не рекомендовано. Тем не менее, представляется перспективным использовать генетические данные для улучшения прогноза развития клинических форм атеросклероза.

Известен способ выявления предрасположенности к развитию атеросклероза на доклиническом этапе путем генетического анализа, отличающийся тем, что определяют наличие фенотипов SS и FS локуса C'3, причем при наличии фенотипа SS локуса C'3 устанавливают генетическую предрасположенность к развитию атеросклеротических процессов, при наличии фенотипа FS локуса C'3, устанавливают генетическую предрасположенность к сдерживанию развития атеросклеротических процессов (патент 2367956, 20.09.2009 год). Способ осуществляют путем идентификации генетических полиморфных систем, методом вертикального электрофореза в нативных условиях в 7,5% полиакриламидном геле на электрофоретической ячейке PROTEAN II xi 2-D фирмы BIO-RAD с использованием генетического анализа. Однако предложенный способ не отличается высокой надежностью получаемых данных и практически не используется в медицинских целях.

Настоящее изобретение относится к идентификации ряда маркеров, обнаруживаемых в крови, и к их применению для упрощения доклинической диагностики и выявления предрасположенности к, атеросклерозу и, особенно, накопления внутриклеточного холестерина. Авторами приняты во внимание данные о том, что иммунный ответ вследствие взаимодействия клеток с модифицированным липопротеидами низкой плотности (ЛНП) стимулирует накопление внутриклеточных липидов [Kidani Y. and Bensinger S.J. Reviewing the impact of lipid synthetic flux on Th17 function // Curr Opin Immunol. 2017. T 46. C. 121-126; Ito A., Hong C., Oka K., Salazar J.V., Diehl C., Witztum J.L., Diaz M., Castrillo A., Bensinger S.J., Chan L. and Tontonoz P. Cholesterol Accumulation in CD11c+ Immune Cells Is a Causal and Targetable Factor in Autoimmune Disease // Immunity. 2016. T 45. C. 1311-1326; Kidani Y. and Bensinger S.J. Modulating Cholesterol Homeostasis to Build a Better T Cell // Cell Metab. 2016. T 23. C. 963-964; York A.G., Williams K.J., Argus J.P., Zhou Q.D., Brar G., Vergnes L., Gray E.E., Zhen A., Wu N.C., Yamada D.H., Cunningham C.R., Tarling E.J., Wilks M.Q., Casero D., Gray D.H., Yu A.K., Wang E.S., Brooks D.G., Sun R., Kitchen S.G., Wu T.T., Reue K., Stetson D.B. and Bensinger S.J. Limiting Cholesterol Biosynthetic Flux Spontaneously Engages Type I IFN Signaling // Cell. 2015. T 163. C. 1716-1729].

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что атерогенез приводит к изменению параметров (активности, экспрессии) генов, которые могут быть определены в образцах крови человека. При проведении транскриптомного анализа макрофагов (одного из важнейших клеточных типов, участвующих в атерогенезе) были выявлены гены, активность которых существенно изменяется при взаимодействии клеток с модифицированными ЛНП. С помощью методов биоинформатики эти гены, тесно связанные с накоплением холестерина макрофагами человека, идентифицированы как IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15.

Таким образом, идентифицированные гены (маркеры, мастер-регуляторы), ответственные за накопление холестерина макрофагами человека, представляют значительный интерес для генодиагностики атеросклероза. Использование множественных маркеров упрощает прогноз прогрессирования заболевания и обеспечивает его более высокую прогностическую значимость.

Задача изобретения - расширение диагностических возможностей атеросклеротических процессов на доклиническом этапе за счет определения экспрессии генов, тесно связанных с накоплением холестерина макрофагами человека (IL7R, IL7, TIGIT, CXCL8, F2RL1, EIF2AK3, TSPYL2, ANXA1, DUSP1 и IL15). Изменения экспрессии генов обусловлены накоплением внутриклеточных липидов при взаимодействии клеток с атерогенными ЛНП.

Поставленная задача решается следующим образом. Из макрофагов цельной крови человека выделяют тотальную РНК с использованием реагента Тризол (Invitrogen, США) согласно рекомендации производителя. С помощью метода обратной транскрипции анализируется мРНК (матричная РНК). Выделение мРНК для транскриптомного анализа осуществляется с использованием набора RNeasy mini-kit (Qiagen, США) согласно протоколу производителя. Синтез кДНК (кодоминантной ДНК) проводится с использованием набора реактивов ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Далее оценивается уровень экспрессии мРНК анализируемых генов методом ПЦР-РВ (полимеразной цепной реакции в режиме реального времени) на приборе 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Для амплификации используется реакционная смесь и праймеры производства фирмы «Синтол» (Россия). В качестве флуорофора для детекции продуктов применяется интеркалирующий краситель SYBR Greenl. Уровень экспрессии мРНК анализируемых генов выравнивают по отношению к усредненным данным амплификации двух генов неизменного уровня экспрессии GAPDH иСАР1.

Более высокий уровень экспрессии мРНК 10 исследуемых генов по сравнению с аналогичными значениями контроля (гены макрофагов здоровых людей) свидетельствует о наличии предрасположенности пациента к атеросклерозу или наличии доклинических признаков этой патологии.