СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к медицине и клинической биохимии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения циркулирующих модифицированных липопротеидов низкой плотности (цмЛНП) с диагностическими и терапевтическими целями.

Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является аккумуляция липидов клетками интимы артерий человека. Показано, что основным источником липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП) [1-4]. Обнаруженные в крови человека модифицированные ЛНП (мЛНП), обладающие пониженным, по сравнению с нативными липопротеидами, содержанием сиаловой кислоты, были названы "десиалированными" ЛНП. Именно десиалированные липопротеиды, в отличие от нативных, вызывают аккумуляцию липидов (в частности, эфиров холестерина) в клетках интимы артерий человека и макрофагах, т.е. являются атерогенными [5-6]. К настоящему времени убедительно экспериментально доказано существование в крови человека цмЛНП, обладающих атерогенными свойствами [7-10]. Известно, что цмЛНП содержат апобелок В-100. Этот апопротеин имеет большое сходство с плазминогеном - белком, который участвует в процессе тромбообразования. Большая концентрация цмЛНП с Апо В-100 в крови говорит о значительном риске атеросклеротических поражений. В клетках-потребителях холестерина существуют рецепторы для цмЛНП. Взаимодействие рецепторов с цмЛНП происходит с помощью Апо В-100, после чего цмЛНП путем эндоцитоза поглощается клеткой. Поскольку ЛНП являются также гликопротеинами, в их состав (а именно в состав апобелка В-100) входят также манноза, галактоза, фруктоза, глюкоза, глюкозамин и сиаловая кислота. Десиалирование Апо В-100 осуществляется присутствующей в крови человека транс-сиалидазой, переносящей сиаловую кислоту между гликоконъюгатами липопротеидов, гликопротеидов и ганглиозидов плазмы и клеток крови. Таким образом, учитывая важную патогенетическую роль цмЛНП в атеросклерозе, остается актуальной разработка наиболее информативных и в то же время относительно простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения цмЛНП. В настоящее время в лабораторной практике недостаточно доступных для рутинных исследований методов определения содержания атерогенных цмЛНП в сыворотке крови человека. Более того, многие предлагаемые способы не учитывают как сложность фракционного состава ЛНП, так и многофакторный, многостадийный характер их модификации, начальным звеном которой является именно процесс десиалирования.

Известен способ определения мЛНП [11], отличающийся тем, что, с целью упрощения определения за счет сокращения числа стадий, супернатант после первого центрифугирования крови инкубируют с красителем. После этого проводят электрофоретическое разделение липидов из фракций крови. Способ включает следующие процедуры: к 1 мл сыворотки крови добавляют 40 мл 8% ПЭГ-6000, инкубируют 1 ч при комнатной температуре и центрифугируют 40 мин при 2800 g. Часть полученного супернатанта повторно центрифугируют 40 мин при 25000 g. Осадок промывают 0,25 мл раствора преципитата после первого и второго центрифугирования и используют для электрофоретического исследования. Разделение проводят в геле агарозы на пластинах, при этом в пробах супернатанта после первого центрифугирования определяют модифицированные липопротеиды высокой плотности, а после второго центрифугирования - модифицированные липопротеиды низкой и очень низкой плотности. Недостатком этого способа являются низкая избирательность метода по отношению как к ЛНП в целом, так и к мЛНП, а также трудоемкость и длительность проведения исследования.

Наиболее интенсивно разрабатываемыми методами определения мЛНП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к мЛНП [12]. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста, выявление только эпитопов, характерных для искусственно модифицированных ЛНП (неспецифичность), а также высокая себестоимость реагентов затрудняет использование их в рутинных исследованиях.

Известен способ экспресс-определения атерогенности крови [13], который состоит в определении множественно модифицированных липопротеидов низкой плотности (ммЛНП) в плазме крови человека путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон 12600±2700, и последующей визуальной регистрацией помутнения по сравнению с контрольной пробой. Наличие помутнения, обусловленной агрегацией ммЛНП, свидетельствует об атерогенности крови. Недостатком этого способа является то, что он выявляет только ммЛНП, которые быстро элиминируются из кровотока при взаимодействии со скавенджер-рецепторами. К тому же ммЛНП связываются с аутоантителами к ним с образованием иммунных комплексов, которые при ряде условий не агрегируются и поэтому у некоторых больных с тяжелым атеросклерозом данный тест дает отрицательный результат.

Известен способ определения минимально модифицированных липопротеидов низкой плотности (Мм-ЛНП) в сыворотке или плазме крови человека [14], который наиболее близок к заявляемому способу по существенным признакам и был выбран в качестве прототипа. При его применении МмЛНП агрегируют из сыворотки или плазмы крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с мол. массой 12600±2700, при конечной концентрации ПВП от 11,3% до 14,2% в пробе. После инкубации в течение 10 мин измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность и при величине разности более 10 ЕД констатируют атерогенность крови у обследуемого человека за счет повышенного уровня Мм-ЛНП. Этот способ также на лишен недостатков, указанных выше, акцентирован на анализе окисленных ЛНП и не позволяет определить содержание в крови цмЛНП.

Таким образом, существует потребность в способе определения, который лишен вышеуказанных недостатков и обеспечивает условия для количественного определения цмЛНП в крови человека.

Задача решается новым способом, который включает определение уровня цмЛНП путем измерения уровня десиалированного апобелка В-100 в сыворотке крови твердофазным лектин-иммуноферментным методом (ИФА) с использованием агглютинина РКА 120, связывающегося с терминальной галактозой в десиалированном апобелке B-100.

Описание способа определения уровня цмЛНП в сыворотке крови.

Для определения содержания цмЛНП в качестве связывающих молекул используют иммобилизованный в планшетах для ИФА на пластиковую подложку рицин-агглютинин РКА 120 (лектин, биологический лиганд к десиалированным гликопротеидам). Наносят сыворотку крови человека с титрованием в разведениях от 1:300 до 1:4800 и инкубируют в течение 2 часов. После инкубации планшеты отмывают для удаления несвязавшихся белков и связавшиеся с лектином десиалированные липопротеиды проявляют поликлональными антителами против апоВ-100 человека, конъюгированными с пероксидазой или биотином. Параллельно определяют общее содержание ЛНП в тех же образцах сыворотки крови традиционным методом ИФА, для чего сыворотку крови человека в разведении 1:8000 наносят на иммобилизованные на пластиковую подложку поликлональные антитела к апоВ-100 и связавшиеся с антителами липопротеиды проявляют поликлональными антителами против апоВ-100 человека, конъюгированными с пероксидазой или биотином. Рассчитывают содержание цмЛНП, общих ЛНП, и затем долю цмЛНП в общем пуле ЛНП. При содержании цмЛНП более 18% от общего пула ЛНП выносят суждение о наличии в крови повышенного уровня цмЛНП и, следовательно, о предрасположенности к развитию атеросклероза.

Преимуществом и существенным отличием предлагаемого метода по сравнению с известными аналогами является прямое количественное определение цмЛНП, а также определение их доли в общем пуле ЛНП. Вторым преимуществом и существенным отличием предлагаемого метода по сравнению с известными аналогами является использование галактозо-специфического лектина в качестве связывающих молекул, избирательно взаимодействующих исключительно с десиалированными гликопротеидами, в число которых входит дегликозилированный (десиалированный) апоВ-100, являющийся гликопротеидным компонентом цмЛНП.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Было проведено измерение содержания цмЛНП и общих ЛНП в 130 образцах сыворотки крови (63 мужчины в возрасте от 27 до 77 лет и 67 женщин в возрасте от 30 до 85 лет) с использованием описанного способа. Количественная диагностика атеросклероза у участников исследования проводилась методом ультразвукового сканирования сонных артерий в режиме высокого разрешения с последующим выявлением атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий и измерением толщины интимо-медиального комплекса сонных артерий. По результатам ультразвукового исследования 62 участника исследования были отнесены к группе здоровых лиц, то есть не имели атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий. К группе больных атеросклерозом, то есть имевших атеросклеротические бляшки в бассейне сонных артерий, были отнесены 68 участников исследования. Среди больных атеросклерозом 35 человек имели клинические проявления атеросклероза в форме ишемической болезни сердца. У здоровых лиц доля цмЛНП в общем пуле ЛНП составила в среднем 12,1% (стандартное отклонение 6,7). У больных атеросклерозом доля цмЛНП в общем пуле ЛНП составила в среднем 27,5% (стандартное отклонение 9,3). Содержание цмЛНП не коррелировало ни с одним из традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Эти данные говорят о том, что содержание цмЛНП в сыворотке крови является независимой дискриминантой для диагностики заболеваний атеросклеротического генеза. Методом построения кривых операторского теста было установлено пограничное значение доли цмЛНП в общем пуле ЛНП, которое составило 18% и позволяло наилучшим образом дифференцировать участников исследования по наличию атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий как инструментального признака атеросклероза.

Пример 2. Была изучена способность нативных ЛНП из крови здоровых доноров вызывать накопление холестерина в первичной культуре моноцитов-макрофагов из крови здоровых доноров. Нативные ЛНП (100 мкг/мл культуральной жидкости) не приводили к увеличению содержания холестерина в клетках. Десиалированные ЛНП, полученные путем обработки нативных ЛНП нейраминидазой, в концентрации 100 мкг/мл культуральной жидкости вызывали 2,4-кратное увеличение содержания холестерина в клетках. Затем исследовали влияние смеси нативных и десиалированных ЛНП (100 мкг/мл культуральной жидкости) на содержание холестерина в клетках при доле десиалированных ЛНП 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% и 50%. Смеси ЛНП, содержащие 1-15% десиалированных ЛНП, не приводили к увеличению содержания холестерина в клетках. Смеси ЛНП, содержащие 20-50% десиалированных ЛНП, приводили к значимому увеличению содержания холестерина в клетках, и этот эффект был дозозависимым. Методом экстраполяции было установлено пограничное значение доли десиалированных ЛНП в общем пуле ЛНП, при котором смесь ЛНП приобретает способность вызывать накопление в клетках, и это значение составило 18%.

Литература

1. Ohlsson, L. Dairy products and plasma cholesterol levels. // Food. Nutr. Res. - 2010. - 54.

2. Forrester, J.S. Redefining normal low-density lipoprotein cholesterol: a strategy to unseat coronary disease as the nation's leading killer. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - Vol. 56. - P. 630-636.

3. Feeman, W.E. Cholesterol guidelines. // Ann. Intern. Med. - 1989. - Vol. 111. - P. 1047-1048.

4. Packard, C.J, Shepherd, J. Low density lipoprotein metabolism. // Prog. Clin. Biol. Res. - 1988. - Vol. 255. - P. 117-123.

5. Tertov V.V., Bittolo-Bon G., Sobenin I.A. et al. Naturally occurring modified low density lipoproteins are similar if not identical: more electronegative and desialylated lipoprotein subtractions. Exp Mol Pathol. 1995; 62(3): 166-172.

6. Tertov V.V., Orekhov A.N., Sobenin I.A. и др. Carbohydrate composition of protein and lipid components in sialic acid-rich and -poor low density lipoproteins from subjects with and without coronary artery disease. J Lipid Res. 1993; 34(3): 365-375.

7. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N. Desialylated low density lipoprotein - naturally occurring lipoprotein with atherogenic potency. Atherosclerosis. 1991; 86: 153-161.

8. Harada L.M. Carvalho M.D., Passarelli M., Quintao E.C. Lipoprotein desialylation simultaneously enhances the cell cholesterol uptake and impairs the reverse cholesterol transport system: in vitro evidences utilizing neuraminidase-treated lipoproteins and mouse peritoneal macrophages. Atherosclerosis. 1998; 139(1): 65-75.

9. Harada L.M. Carvalho M.D., Passarelli M., Quintao E.C. Lipoprotein desialylation simultaneously enhances the cell cholesterol uptake and impairs the reverse cholesterol transport system: in vitro evidences utilizing neuraminidase-treated lipoproteins and mouse peritoneal macrophages. Atherosclerosis. 1998; 139 (1): 65-75.

10. Lindbohm N., Gylling H., Miettinen Т.Е., Miettinen T.A. Statin treatment increases the sialic acid content of LDL in hypercholesterolemic. Atherosclerosis. 2000; 151(2): 545-550.

11. Карпов P.C., Канская H.B., 1992. Способ определения модифицированных липопротеидов крови (RU 1720015): СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (я)5 G01N 33/92, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР.

12. Virella G., Derrick MB., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V. 12, №1. - P. 68-75.

13. Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ экспресс-определения атерогенности крови. Патент РФ №2437098 от 20.12.2011 г., Бюл. №35.

14. Шойбонов Б.Б. Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека. Патент РФ №2501013. Официальная публикация патента 10.12.2013.