1,20-Дибром-3,6,9,12,15,18-гексаоксаперфтор-4,7,10,11,14,17-гексаметилэйкозан в качестве исходного соединения для эмульсий медико-биологического назначения и способ его получения

Изобретение относится к области фармацевтической химии и технологии, а именно к синтезу 1,20-дибром-3,6,9,12,15,18-гексаоксаперфтор-4,7,10,11,14,17-гексаметилэйкозана (1) в качестве исходного соединения для получения оксигенирующих эмульсий, используемых как терапевтические средства наружного применения (кремы, мази, линименты), а также как оксигенирующий компонент культуральных сред в биотехнологических процессах [1].

Ранее было показано, что оксигенирующие композиции для наружного применения, полученные на основе перфтордекалина и/или его смеси с перфторметилциклогексилпиперидином (препарат «Перфторан»), перфтороктилбромида, перфтортрипропиламина, при местном применении ускоряют процесс заживления зубных лунок, ожоговых ран и нарушения трофики [RU 2237473, RU 2225209, RU 2259819; КЛИГУНЕНКО Е.Н. и др. 1999; Хрупкин В.И. и др. 1997]. Ключевые механизмы: подавление развития патогенной анаэробной микрофлоры, значимое улучшение кровотока (микрокатализ с участием NO) у животных и у людей, а также трофики в целом, подавление вторичного повреждения, вызываемого активными формами кислорода, которые продуцируют гиперактивированные лейкоциты, уменьшение гнойной инфильтрации и соответствующее ускорение регенерации при подсадке лоскута, выдержанного сутки в оксигенирующей эмульсии (например, в перфторане).

В то же время вышеперечисленные фторуглероды и эмульсии на их основе имеют ряд существенных недостатков. Температуры кипения этих фторуглеродов лежат в интервале 130°C (перфтортрипропиламин) - 185°C (перфторметилциклогексилпиперидин), т.е. обладают достаточно высокой летучестью, а их эмульсии недостаточно стабильны при стерилизации в автоклаве при 120°C и длительном хранении (эмульсия перфторана должна храниться в замороженном состоянии при минусовых температурах).

Целью настоящего изобретения является синтез фторсодержащих соединений, обладающих, подобно другим фторуглеродам, высокой растворяющей способностью по отношению к кислороду и характеризующихся пониженной летучестью, повышенной, по сравнению с перфторалканами, липофильностью, и образующие эмульсии, устойчивые как при длительном хранении при плюсовых температурах, так и при стерилизации в автоклаве при 120°C.

Указанная цель достигается синтезом 1,20-дибром-3,6,9,12,15,18-гексаоксаперфтор-4,7,10,11,14,17-гексаметилэйкозана формулы образующегося при анодном окислении (электросинтезом Кольбе) 11-бром-3,6,9-триоксаперфтор-2,5,8-триметилундекановой кислоты и характеризующегося низкой летучестью (т. кип. 117-119°C/1Torr):

Кислота 2 легко получается омылением соответствующего фторангидрида формулы описанного в [2]. Очистка дибромида 1 до фармакопейной чистоты (содержание фторид-иона не более 5×10^-5 вес. %) достигается его обработкой 40%-ным водн. раствором K₂CO₃ с последующей перегонкой в вакууме.

Дибромид 1 характеризуется высокой растворяющей способностью по отношению к кислороду (53 об. % при рО₂ 760 мм. рт.ст.) и в присутствии эмульгаторов при экструзии под высоким давлением образует 10%-ные водные субмикронные эмульсии, стабильные при длительном хранении без замораживания при 8÷10°C, выдерживающие стерилизацию в автоклаве при 121°C.

При внутривенном введении прямых субмикронных эмульсий дибромида 1 в воде, полученных на гомогенизаторе модели «Донор» при давлении до 800 кг/см² со средним диаметром частиц от 30 до 120 нм (по показаниям лазерного наносайзера Coulter 15 фирмы Becman-Coulte, США), лабораторным крысам линии Wistar в дозе 50 мл на кг массы тела признаков токсического воздействия на животных не обнаружено. После внутривенного введения полученных эмульсий в дозе 20 мл на кг кроликам - высокочувствительным к эмульсионным препаратам - также признаков повреждения не выявлено, и кролики прожили более года до искусственной?? (есть естественная?) эвтаназии.

Использование дибромида 1 в качестве оксигенирующего компонента питательной среды при глубинном культивировании S. purpurogeniscleroticus ВБМ 81 (по методике, описанной в работе [1]) привело к ускорению роста и увеличению выхода биомассы стрептомицета в ~3,5 раз и выхода даунорубицина в ~10 раз. Потери дибромида 1 в цикле культивирование-стерилизация составляют не более 0,5%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об эффективности применения дибромида 1 в биотехнологических процессах.

Для лучшего понимания настоящего изобретения приводим примеры получения дибромида 1 и эмульсий на его основе.

Пример 1. Получение кислоты 2.

К смеси 30 г (44 ммол) и 10 мл гептана прибавили 5 мл (280 ммол) воды, интенсивно перемешивали 30 мин, прибавили 5 мл H₂SO₄, органический слой отделили, перегнали в вакууме, собирая фракцию, кипящую в интервале 90-150°/1Torr. Повторной перегонкой получили 24,7 г (82,6%) 11-бром-3,6,9-триоксаперфтор-2,5,8-триметилундекановой кислоты (2), т.кип. 133-135°/17Torr. Найдено %: С 20,00; Н 0,20; F 56,37; Br 11,36. C₁₁BrHF₂₀O₅. Вычислено %: С 19,61; Н 0,15; F 56,43; Br 11,89.

Пример 2. Получение дибромида 1.

В электролизер снабженный водяной рубашкой, магнитной мешалкой и обратным холодильником загружают 9.8 г (14 ммол) кислоты 2, 0,122 г (2,2 ммол) КОН, 1 мл H₂O и 29 мл CH₃CN. Анод - сплав платина +10% иридия (15 см²). Катод - нержавеющая сталь (2 см²). Плотность тока 51.6 мА.см^-2. Ток - 0,8 А, температура электролиза 20°C. Теоретическое количество электричества в расчете на израсходование 11,8 ммол кислоты 2 составляет 0,32 А⋅час. Всего пропущено 0,37 А⋅час электричества. Исходное напряжение на электролизере 24 В. Конечное напряжение на электролизере после 28 минут электролиза составило 40 В. По окончании электролиза электролит промыли водой, 40%-ным водным раствором K₂CO₃, органический слой отделили, перегнали и получили 7,1 г (80% выход по веществу) и (72% выход по току) 1,20-дибром-3,6,9,12,15,18-гексаоксаперфтор-4,7,10,11,14,17-гексаметилэйкозана 1, т. кип. 117-119°C/1Torr. Найдено %: С 19,09; F 60,43; Br 12,38. C₂₀Br₂F₄₀O₆. Вычислено %: С 19,11; F 60,51; Br 12,74.

Спектр ¹⁹F ЯМР1:

BrCF₂CF₂OCF(CF₃)CF₂OCF(CF₃)CF₂OCF(CF₃)CF(CF₃)OCF₂CF(CF₃)OCF₂CF(CF3)OC F₂CF₂Br

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

-71,1 + -72,0 (2F¹ + 2F²⁰); -80,45÷-86,14 (группа сигналов 30F^{2+4+5+7+8+10+12+13+15+16+18+19});.-143,2 (1F⁹+1F¹¹); -147-147.5 (1F^3+6+14+17).

Масс-спектр 1 (M/Z, отнесение): 727 [C₁₂BrF₂₄O₃]⁺; 705 [C₁₂BrF₂₂O₄]⁺; 667 [C₁₂F₂₅O₃]⁺; 611 [C₁₂BrF₂₂O₃]⁺; 551 [C₁₀F₂₁O₂]⁺; 529 [C₁₀F₁₉O₃]⁺; 511 [C₈BrF₁₆O₂]⁺; 395 [C₆BrF₁₂O₂]⁺; 385 [C₈BrF₁₆O₂]⁺; 345 [C₅BrF₁₀O]⁺; 335 [C₆F₁₃O]⁺; 313 [C₆F₁₁O₂]⁺; 285 [C₅F₁₁O]⁺; 229 [C₃BrF₆]⁺; 219 [C₄F₉]⁺; 179 [C₂BrF₄]⁺ (100%); 147 [C₃F₅O]⁺; 131 [C₃F₅]⁺; 100 [C₂F₄]⁺; 69 [CF₃]⁺.

Пример 3. Очистка дибромида 1.

Смесь 20 г дибромида 1 и 10 мл 40%-ного водн. раствора K₂CO₃ интенсивно перемешивали 5 час при 50-70°C, летучие продукты отогнали в охлаждаемый приемник (-78°C) в вакууме сначала водоструйного, а затем масляного насоса. Дистиллят отогрели, органический слой отделили, высушили над MgSO₄ и перегонкой в вакууме получили 19 г дибромида 1 (т. кип. 117-119°C/1 Torr) с содержанием фторид-иона 1,5×10^-5%.

Пример 4. Получение эмульсии на основе дибромида 1.

В 100 весовых частях дистиллированной воды растворяли 10 весовых частей неионогенного поверхносто-активного соединения Плюроника F68 и при постоянном интенсивном перемешивании на турбинной мешалке при скорости вращения 8000 оборотов в мин к полученному раствору добавляли 20 объемных частей дибромида 1. В результате получали грубодисперсную эмульсию с распределением частиц по размерам от 10 мкм до 1000 мкм. Грубодисперсную эмульсии измельчали путем экструзии по давлением от 350 до 800 ат (кг/см²) до достижения среднего размера 100 нм при распределении частиц по размерам от 30 нм до 160 нм. Далее полученную нанодисперную эмульсию, содержащую 20 об. % бромированного перфторуглерода, смешивали с равным объемом водно-солевого раствора. Таким образом получалась изотоничная биологическим жидкостям готовая форма, содержащую 10 об. % бромированного перфторуглерода, 4% Плюроника F68,100 mM NaCl, 5 mМ KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM Na₂HPO₄,8 mM NaHCO₃, (pH 7,3). NaCl - 5,85 g, KCl - 0,375 g, MgCl₂ - 0,1 g, Na₂HPO₄ - 0,376 g, NaHCO₃ - 0,67 g. (В расчете на 1 л. эмульсии)

Готовую форму 10% эмульсии хранили без замораживания при температуре .

Пример 5. Получение эмульсии на основе бромида 1 (вариант 2).

Аналогично получена эмульсии на основе бромида 1 с использованием Проксанола 268 в качестве ПАВ со средним размером частиц 100 нм при распределении частиц в интервале 30-180 нм. Готовую форму 10% эмульсии хранили без замораживания при температуре 2÷6°C. Размер частиц контролировали с помощью лазерного наносайзера.

Пример 6. Применение эмульсии для лечения Ожеговых ран.

Полученную по примеру 4 наноэмульсию с содержанием 20 об % фторгулеродной фазы без солевого раствора со средним размером частиц 120 нм в количестве 50 мл добавляли порционно по 5 мл в официнальную мазь, предназначенной для стимуляции заживления кожных покровов, полученную согласно описанию патента Российского патентна №2026072, перемешивали с помощью механической мешалки до получения однородной массы. Полученную модифицированную мазь в количестве 1 г. наносили дважды с интервалом 2 дня на обожженную кожу крыс в межлопаточной области. В контрольных экспериментах, выполненных на 7 крысах-самцах линии Вистар общей массой 300 г, использовали мазь исходной рецептуры. В опытной группе, также состоящей из 7 животных использовали для лечения ожога модифицированную эмульсией мазь. При ежедневном контроле состояния ожоговой раны фиксировали изменение площади ожога и время освобождения раны от ожогового струпа. При использовании полученной согласно описанию модифицированной мази площадь ожога уменьшалась существенно быстрее так, что рана освободилась от струпа в опытной группе через 6-7 дней, тогда как в контрольной группе процесс эпителизации и освобождения раны от струпа занимал в среднем 11 дней.

Пример 7. Использование дибромида 1 в качестве компонента культуральных сред. Влияние дибромида 1 на биосинтез даунорубицина культурой S. Purpurogeniscleroticus ВБМ 81.

Культивирование стрептомицета S. Purpurogeniscleroticus ВБМ 81 в среде на основе соевой муки (исходная концентрация микробной культуры - 0,5 мг/см³, инкубирование выполняли на шуттеле в течение 10 суток при 28-29°C, 230 об/мин) в присутствии 2 об. % дибромида 1, что привело к увеличению биомассы стрептомицета в 3,5 раза и выхода даунорубицина в 10,2 раза по сравнению с контрольным опытом.

Литература

1. А.Ю. Плетнева, диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М., МГА ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, 2007.

2. RU 2237473 Дроботов В.Н. Кричевский А.Л. (RU); Галеев И.К. (RU); Лоскутников С.Ю. (RU); Казанин К.С. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАН

3. RU 2225209 Захаров В.Ю. Горшков Ю.В. Дедов А.С. Любимов А.Н. Осипов А.П. Средство для лечения ожогов и ран.

4. RU 2259819 Кузнецова И.Н., Маевский Е.И., Германов Евгений Павлович. ЭМУЛЬСИЯ ПЕРФТОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

5. RU 2026072 Оксиноид О.Э„ Сидляров Д.П., Захаров В.В., Николаев А.В., Ахсянов У.У., Литвиненко Ю.А., Краснопольский Ю.М., Темиров Ю.П.. СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

6. КЛИГУНЕНКО Е.Н. и др. Местное применение перфторана в комплексном лечении длительно заживающих ран, в кн.: Перфторорганические соединения в биологии и медицине. - Пущино, 1999, с. 146-149.

7. Хрупкин В.И. Писаренко Л.В. Мороз В.В. Хоменчук А.И Использование эмульсии перфторуглеродов в местном лечении ран, осложненных хирургичекой инфекцией Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 1997, T. 156, N4. C. 53-55.

8. RU 2497801 Михайлова З.А., Тютюнов А.А., Игумнов С.М., Стерлин С.Р. Окса- и полиоксаперфторалкилбромиды и способ их получения.