Способ определения противомикробной активности цельной сыворотки и фракции её антимикробных пептидов

Область техники

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии. Изобретение предназначено для определения общей антимикробной активности и совокупной активности антимикробных пептидов (АМП) в клинических образцах сыворотки крови посредством действия данных образцов на клетки тест-культур микроорганизмов и спектрофотометрического измерения процента красителя, вошедшего в убитые клетки, по сравнению с контролем. Такой подход позволяет установить нормальный и патологический уровень гуморальной противомикробной иммунной защиты организма и усовершенствовать тактику лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, то есть, решить вопрос о проведении иммунотерапии.

Уровень техники.

Обычно для постановки диагноза и разработки схемы лечения инфекционно-воспалительных заболеваний клиницист использует микробиологические и иммунологические исследования. Защитный потенциал конкретного пациента оценивают путем определения иммунного статуса, в который входят многие показатели клеточного и гуморального иммунитета. Гуморальная (сывороточная) противомикробная защита организма складывается из иммуноглобулинов, белков системы комплемента и антимикробных пептидов/ полипептидов (АМП). Независимо от того, какой путь действия системы комплемента реализуется - классический или альтернативный, а также от механизма действия иммуноглобулинов и различных АМП (которых в сыворотке крови свыше 25), происходит прежде всего повреждение клеточной мембраны патогенных микроорганизмов или их лизис. На этом свойстве сыворотки основаны все известные до сих пор методы оценки ее бактерицидности. Метод определения бактерицидных свойств крови входит в "Номенклатуру клинических лабораторных исследований" (п.6.3.2-общие бактерицидные свойства сыворотки крови, секретов), утвержденную Приказом Министерства здравоохранения РФ №64 от 21.02.2000 г. Однако в широкой клинической практике этот метод не нашел применения, очевидно, в силу объективных причин - трудоемкости, длительности выполнения и др. Тем не менее, такой показатель, как прямая противомикробная активность сыворотки, является очень важным.

Методы определения антимикробной активности сыворотки крови и ее компонентов можно разделить на две группы. К первой группе можно отнести "бактериологические" методы, которые основаны на подсчете количества микроорганизмов, обработанных сывороткой крови, по сравнению с контролем. Учет в данном случае проводят путем посева на плотные питательные среды.

Ко второй группе относятся "фотонефелометрические" методы, основанные на оптической регистрации задержки роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде. Вышеперечисленные методы трудоемки и требуют больших затрат времени.

Так, из уровня техники известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, в котором предлагается использование природных или рекомбинантных люминесцирующих бактерий, характеризующиеся прямой пропорциональностью между интенсивностью снижения уровня спонтанной биолюминесценции и выраженностью бактерицидного эффекта. Авторы в качестве примера приводят использование штамма Escherichia coli с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi. (патент RU 2247987, приоритет 22.01.2003)

К недостаткам данного метода можно отнести модельную тест-культуру, которая не является естественным патогенным микроорганизмом, поэтому может обладать иной чувствительностью к сывороточным антимикробным соединениям, чем штаммы, выделяемые от больных.

Известен также способ определения антимикробной активности пептидов, основанный на свойстве АМП нарушать цитоплазматическую мембрану микроорганизмов (Zimmerman LB1, Worley BV, Palermo EF, Brender JR, Lee KD, Kuroda K, Ramamoorthy A, Meyerhoff ME. Absorbance-based assay for membrane disruption by antimicrobial peptides and synthetic copolymers using pyrroloquinoline quinone-loaded liposomes. AnalBiochem. 2011 Apr 15;411(2): 194-9. doi: 10.1016/j.ab.2011.01.009. Epub 2011 Jan 13). Однако исследователи предлагают использовать не суммарную фракцию АМП, а индивидуальные, причем синтетические аналоги природных АМП. В качестве тест-объекта они используют специально созданную модель - липосомы. Метод требует больших расходов на реактивы (ферменты, пирролохинолин хинон), и не предполагает получения данных об истинной активности АМП против естественных патогенов.

Известен способ определения уровней АМП (Arzumanian V., Shmeleva О., Michailova N. (2017) Elevated Activity Levels of Serum Antimicrobial Peptides in Mice as Response to Immunization with Yeast Antigens, Med Mycol Open Access Vol. 3 No. l), однако, он был реализован в опытах на мышах и, таким образом, не содержит данных касающихся человеческих сывороток, а именно, норм величин антимикробной активности цельных сывороток и их АМП-фракций.

Для оценки противомикробной защиты в клинике пользуются анализами количественной оценки иммуноглобулинов. Несмотря на то, что методы количественной оценки отдельных АМП разработаны, исследования в этой области носят сугубо фундаментальный характер. Кроме того, их действие в организме складывается не столько из суммы их количеств, сколько из их совокупной активности в отношении микробных агентов. Известно, что белки системы комплемента продуцируются в основном гепатоцитами, сывороточные иммуноглобулины - В-лимфоцитами, а сывороточные АМП - в основном нейтрофилами. Молекулярная масса иммуноглобулинов и подавляющего большинства белков комплемента выше 150 кДа, тогда как мол. масса АМП варьирует в пределах 2,8 - 80 кДа. Таким образом, определив совокупную противомикробную активность низкомолекулярной фракции, можно судить об активности АМП, т.е. об эффективности их синтеза нейтрофилами. В этой связи, очевидно, что для клинической диагностики, наряду с общей противомикробной активностью сыворотки, большое значение имеет такой показатель, как совокупная активность АМП.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ определения совокупной активности антимикробных пептидов как маркера состояния местного иммунитета различных эпителиальных тканей (патент на изобретение №2602298 от 21.10.2016). Данный метод предназначен для оценки противомикробной активности таких биожидкостей, как слюна, урина, вагинальный и кожный секреты, но не для сыворотки крови. Недостатком данного способа по сравнению с предлагаемым является использование более трудоемкого и длительного метода микроскопии образцов с подсчетом количества убитых клеток.

Задачей изобретения является разработка способа определения противомикробной активности цельной сыворотки и совокупной активности фракции антимикробных пептидов как маркеров состояния отдельных звеньев гуморального иммунитета организма человека, позволяющий за короткое время количественно оценить способность сыворотки крови противостоять инфекционным агентам.

Техническим результатом изобретения является возможность оценить общую противомикробную активность и совокупную активность антимикробных пептидов сыворотки крови. Для определения совокупной активности АМП используется быстрый метод спектрофотометрический метод оценки процента красителя, поглощенного убитыми клетками, по сравнению с контролем, вместо более длительного и трудоемкого метода микроскопирования и подсчета процента убитых клеток. Применение данного метода позволяет на основании количественных критериев определить состояние нормы или дефицита общей противомикробной активности сыворотки и совокупной активности сывороточных АМП.

Для решения поставленной задачи мы предлагаем способ определения общей противомикробной активности и совокупной активности антимикробных пептидов сыворотки крови человека, заключающийся в том, что в качестве образца сыворотки осуществляют сбор крови, затем образец освобождают от форменных клеток крови путем центрифугирования и делят на две аликвоты, одну из которых фильтруют через молекулярный фильтр с размером пор 100 кДа, затем обе аликвоты и контрольный образец, содержащий физраствор вместо компонентов сыворотки, соединяют в определенном соотношении с суспензией клеток экспоненциальной культуры микроорганизмов, после чего приготовленные смеси инкубируют в термостате 2 часа, центрифугируют и к полученным осадкам добавляют раствор бромкрезолового пурпурного для окрашивания убитых клеток, затем вновь термостатируют и центрифугируют, а оптическую плотность полученных супернатантов измеряют на спектрофотометре и рассчитывают процент красителя, поглощенного убитыми клетками опытных образцов в сравнении с контрольным образцом, что и отражает общую противомикробную активность сыворотки и ее совокупную активность АМП.

В частном случае для определения антимикробной активности АМП данную фракцию сыворотки соединяют с клетками грибов Candida albicans, либо грибов Cryptococcus neoformans, либо бактерий Staphylococcus aureus, либо бактерий Escherichia coli.

Краткое описание чертежей и иных поясняющих материалов

Таблица 1. Противомикробная активность цельной сыворотки и активность АМП сыворотки с молекулярной массой менее 100 кДа у здоровых добровольцев.

Таблица 2. Противомикробная активность цельной сыворотки и активность АМП сыворотки с молекулярной массой менее 100 кДа у здоровых добровольцев и пациентов с сепсисом.

Таблица 3. Противомикробная активность цельной сыворотки и активность АМП сыворотки с молекулярной массой менее 100 кДа у здоровых добровольцев, которую оценивали в отношении нескольких культур условно-патогенных грибов и бактерий.

Осуществление изобретения

Способ был реализован для разных видов сывороток и микроорганизмов. Ниже приведены примеры реализации способа.

Пример 1.

Образец венозной крови объемом 2 мл инкубируют 1 час, центрифугируют 5 мин со скоростью 10000 об/мин и полученный супернатант делят на две части, одну из которых отделяют (фракция I), а другую объемом 0,5 мл фильтруют через молекулярный фильтр «Amicon» с диаметром пор 100 кДа на центрифуге в течение 15 мин при 16000 об/мин (фракция II), после чего по 300 мкл из обеих фракций соединяют в пробирках типа Эппендорф с 50 мкл суспензии дрожжей С. albicans №927, полученной из культуры этих дрожжей, выращенной на среде Сабуро в течение 20 часов при 25 градусах и приготовленной из расчета 1 петля 1 мм, суспендированная в 50 мкл физраствора; контролем является пробирка, в которой 300 мкл физраствора, соединяют с 50 мкл упомянутой смеси; пробирки инкубируют 2 часа при 32 градусах на шейкере, затем центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин, супернатанты осторожно удаляют, а к осадкам добавляют по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном буфере рН 4,6, суспендируют и инкубируют 45 мин при 32 градусах на шейкере; после этого 5 мин при 10000 об/мин, супернатанты - по 250 мкл - собирают в отдельную пробирку для каждой пробы, перемешивают и оттуда вносят по 50 мкл в заранее подготовленные пробирки, содержащие по 2,5 мл фосфатного буфера рН 4,6; полученные растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 440 нм в кюветах 1 см; из трех измерений для каждой пробы вычисляют среднее значение оптической плотности, затем производят расчет по формуле:

А=(ОП_контр. - ОП_опыт.)* 100 / ОП_контр.,

где А - противомикробная активность цельной сыворотки или полученной фракции ее антимикробных пептидов, выраженная в процентах.

ОП_контр. - это оптическая плотность смеси из контрольной пробирки; ОП_опыт. - это оптическая плотность смеси из пробирки фракции I либо фракции II.

Таким образом обрабатывали сыворотки 15 здоровых добровольцев (табл. 1). При этом определяли количественные критерии нормальной противомикробной активности цельной сыворотки и полученной фракции ее антимикробных пептидов.

Пример 2. Образцы крови обрабатывали аналогично примеру 1, но в исследование были включены: контрольная группа - здоровые добровольцы и пациенты с сепсисом, противомикробную активность также оценивали в отношении дрожжей Candida albicans. Результаты приведены в табл. 2. Как видно из приведенных результатов, дефицитное состояние противомикробной активности цельной сыворотки и полученной фракции ее антимикробных пептидов диагностируется при показателях 72% и 21% соответственно.

Достоверность различий рассчитывали по критерию Манна-Уитни.

Пример 3. Образцы крови обрабатывали аналогично примеру 1, но исследование проводили только на сыворотках крови 6 здоровых добровольцев, причем активность оценивали в отношении нескольких культур условно-патогенных грибов и бактерий (таблица 3). Величины противомикробной активности цельных сывороток против разных видов микроорганизмов в норме варьируют от 72% до 92%, тогда как активность АМП-фракций - в пределах от 20% до 51%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и точно оценить общую противомикробную активность и совокупную активность антимикробных пептидов сыворотки крови и охарактеризовать ее состояние как нормальное или дефицитное.